长链非编码RNA编码肽在肿瘤中的作用机制

孟一妹，蒋 晶，王禹涵，孟一姊，闫 昱，李佩玲

长链非编码RNA(lncRNA)长度一般超过200个核苷酸，既往学者认为其缺乏开放的读码框架，故不具备蛋白质编码功能[1]。lncRNA在多个层面上参与基因的表达及调控，在多种肿瘤中呈异常表达并且与肿瘤发生和发展密切相关[2]。近年来有研究发现，lncRNA的短开放阅读框(sORF)可以编码功能肽，lncRNA可以有一个或多个sORF，能够被翻译成<100个氨基酸长的小肽，只是一般基因注释流程都默认过滤掉100个氨基酸以下的肽，认为这些是假阳性的结果[3]，故一直以来都被忽略。随着新一代测序技术及生物信息学技术的提高，人们才发现这些非编码RNA分子其实也是普遍翻译的，从而打开了lncRNA编码肽的研究大门[4-5]。lncRNA编码肽被证实在细胞分裂、钙及线粒体代谢和毒素降解中发挥重要作用，并且在肿瘤发生和发展中有潜在应用前景[6-11]。本文就lncRNA编码肽在肿瘤中的作用机制作一综述如下。

1 lncRNA编码肽与结肠癌

结肠癌是常见消化系统肿瘤之一。在美国，结肠癌是仅次于肺癌的第二大死因[12]。有学者利用实时荧光定量聚合酶链反应及微阵列数据集发现，与正常组织相比，HOXB-AS3 RNA在结肠癌组织中下调；通过核糖体分析显示HOXB-AS3 RNA与核糖体结合具有翻译可能性，lncRNA HOXB-AS3包含一个159 nt的sORF，该sORF可编码一个53 aa肽；通过构建sORF的标签载体，体内外等一系列实验显示，HOXB-AS3小肽而不是lncRNA发挥着功能，HOXB-AS3小肽能够抑制结肠癌的进展；生物信息学分析发现与HOXB-AS3小肽相互作用的蛋白与RNA剪切相关；其进一步挑选了剪切抑制因子hnRNPA1作为研究对象，实验得出在肿瘤细胞中，HOXB-AS3小肽的表达缺失使PKM基因的剪切形式为保留10号外显子，而非9号外显子，从而介导PKM2剪切体形成，抑制PKM1剪切体形成，最终导致肿瘤细胞有氧糖酵解，促使结肠癌发生和发展[13]。总之，HOXB-AS3多肽低表达与结肠癌预后差密切相关，可以作为结肠癌的预后标志物。

随后上述团队陆续发现2个可编码肽的lncRNA。第1个是lncRNA LOC90024[14]。通过上述实验方法证实lncRNA LOC90024可编码一个130 aa的小肽；通过质谱检测及对小肽的进一步功能分析证实，该小肽是人体细胞和组织中自然产生的内源性物质，且是小肽而不是lncRNA LOC90024本身促使了结肠癌的发生、发展和侵袭、转移。随后其通过蛋白质相互作用组学等证实此小肽主要与mRNA剪切调控分子相互作用，于是将此小肽命名为剪切分子调控小蛋白SRSP，SRSP与剪接因子SRSF3相互作用。他们进一步实验证实SRSP增强了SRSF3与转录因子Sp4 pre-mRNA 外显子3的结合，介导外显子3的包含，从而促使长的Sp4剪切体(L-Sp4)产生，抑制短的Sp4剪切体(S-Sp4)产生。该团队在Sp4-KD型结肠癌细胞中恢复了L-Sp4或S-Sp4的表达，发现L-Sp4刺激肿瘤的发生。综上所述，lncRNA LOC90024编码一个小蛋白SRSP，调控Sp4剪接和结肠癌的发生，SRSP可作为一种新的结肠癌预后生物标志物和治疗靶点。

m6A是最普遍的真核RNA修饰。RNA m6A修饰的生物学重要性依赖于m6A结合蛋白(即m6A读卡器)，通过调节mRNA的稳定性、翻译、剪接、结构、衰老和亚细胞定位来控制mRNA的命运[15-18]。上述团队发现的第2个可编码肽的lncRNA是LINC00266-1[19]。LINC00266-1编码一个71个氨基酸的多肽，通过质谱分析等发现此多肽主要与RNA结合蛋白结合，故将其命名为RNA结合调节多肽(RBRP)。RBRP为内源性产生的多肽，表达上调与结肠癌的恶性表型和临床预后差密切相关。通过组学分析、免疫共沉淀及功能实验等发现RBRP与RNA m6A读码器IGF2BP1相互作用。既往研究表明C-Myc是最重要的致癌基因之一[20]，RBRP作为m6A读码器的调节亚基，通过m6A读码器IGF2BP1增强m6A对C-Myc mRNA的识别，增加C-Myc mRNA的稳定性和表达，促进肿瘤发生。综上所述，LINC00266-1实际上编码了一种未标记的肽RBRP，该肽在肿瘤发生过程中具有促进作用，这一发现突出了靶向RBRP治疗癌症的潜力。

2 lncRNA编码肽与乳腺癌

三阴性乳腺癌不表达3种最常见乳腺癌标志物，是最具侵袭性乳腺癌亚型，预后较差，总生存期较短[21]。有学者从TCGA数据库中识别出三阴性乳腺癌特异性lncRNA，并使用GWIPS-viz数据集等发现具有编码潜力的LINC00908；通过免疫荧光、Western blot和多聚体分析实验等验证了LINC00908可编码一个60个氨基酸名为ASRPS的多肽，且在三阴性乳腺癌细胞株中ASRPS呈低表达;体外实验证实LINC00908可通过ASRPS抑制三阴性乳腺癌肿瘤生长;Log-rank检验和Kaplan-meier生存曲线分析发现ASRPS低表达的三阴性乳腺癌患者总生存期短于ASRPS高表达的三阴性乳腺癌患者；荧光素酶报告基因、序列缺失和CHIP实验等发现ERα直接调控LINC00908转录；进一步通过COIP、免疫组织化学及使用CRISPR/cas9介导的同源重组等技术研究得出ASRPS直接与STAT3结合，下调STAT3磷酸化，导致血管内皮生长因子表达降低；最后在小鼠模型中，再次证实ASRPS高表达减少血管生成，抑制肿瘤生长[22]。总之，LINC00908编码的多肽ASRPS是三阴性乳腺癌特异性治疗靶点。

随后该团队发现一个可编码肽的lncRNA[23]。LINC00665可编码一个55个氨基酸的内源性表达小肽，并命名为CIP2A-BP。通过检测两个独立临床中心的三阴性乳腺癌样本后，发现由LINC00665编码的小肽与三阴性乳腺癌的预后不良有关。体外敲除和过表达研究证实是CIP2A-BP抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而不是LINC00665。经免疫共沉淀和质谱鉴定等方法发现了该小肽可以与肿瘤致癌基因CIP2A结合，取代PP2A的B56γ亚基，从而释放PP2A活性，进而可以抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活，影响下游基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和Snail等基因的表达，以此参与了三阴性乳腺癌的转移和侵袭。最后该团队在小鼠模型中引入CIP2A-BP基因或直接注射CIP2A-BP发现可减少肺转移并提高总体生存率。总之，该团队发现在三阴性乳腺癌中，转化生长因子β经下调CIP2A-BP的翻译，通过CIP2A/PP2A和PI3K/AKT/NF-κB信号通路诱导肿瘤侵袭和转移，CIP2A-BP可作为一种抗肿瘤肽在未来治疗中发挥作用。

3 lncRNA编码肽与肝癌

Pang等[24]利用抗核糖体蛋白S6(RPS6)抗体对4种癌细胞系进行RNA免疫沉淀并测序，并对最显著富集的lncRNA进行开放阅读框预测和编码潜力评估，通过公共数据库分析所选lncRNA在肝癌中的表达，发现LINC00998上调显著，且其表达水平与肝癌患者的生存率显著相关。随后其利用Uniprot基于同源性预测LINC00998可能编码一个含有59个氨基酸的肽，并命名为SMIM30。通过构建载体、质谱分析、Western blot实验及荧光成像等实验证实了SMIM30的内源性表达，并且是SMIM30，而不是LINC00998本身，通过调节细胞增殖和迁移来促进肝癌的发生。SRC/YES1是一种酪氨酸激酶，该团队通过实验证实SMIM30是SRC/YES1膜锚定和激活状态的重要适配子。通过转录组测序手段等验证SMIM30激活下游MAPK通路，利用生物信息学手段测SMIM30启动子区域存在转录因子C-Myc的结合位点。进一步实验证实了C-Myc转录调控肝细胞癌细胞中SMIM30的表达，SMIM30激活MAPK信号通路促进了肝细胞癌进展。总之，LINC00998编码的SMIM30可能是肝癌新的预后指标，并可能为肝癌治疗提供一个特异性靶点。

乙型肝炎病毒慢性感染与肝癌发生密切相关[25]。Jia等[26]采用抑制消减杂交法从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选到一个新基因，即lncRNA HBVPTPAP，用于研究HBV DNA聚合酶的反调节。据其全长序列的结构特点，将其归类为lncRNA。该团队为了进一步识别lncRNA HBVPTPAP的编码潜力，使用CNCI、CPAT、CPC2和PhyloCSF等在线工具分析其编码潜力，构建了pcDNA-ORF和pcDNA-ORF-gfp，并将其转染到HepG2细胞中，验证编码肽的存在。进一步对HBVPTPAP基因过表达或敲低研究发现当HBVPTPAP基因过表达时，凋亡相关蛋白Bax上调，Bcl-2下调，说明HBVPTPAP基因可显著促进凋亡；当HBVPTPAP基因过表达时，细胞色素C表达增加，pSTAT3相对表达降低，Bax/Bcl-2值降低。上述结果表明，在线粒体参与下，HBVPTPAP可能通过抑制pSTAT3活性促进细胞凋亡。

4 lncRNA编码肽与头颈癌

大多数头颈癌起源于口腔、咽、喉的黏膜上皮，统称为头颈鳞状细胞癌。目前，临床上头颈鳞状细胞癌的治疗方法包括手术和放疗、化疗等[27]。Li等[28]利用生物信息学手段筛选出差异表达的lncRNA RP11-469H8.6，发现其存在一个潜在的sORF，可能编码一个含有51种氨基酸的未报道微肽。通过免疫荧光、CRISPR/cas9介导的同源重组、质谱及Western blot技术证实该微肽为内源性表达，其在头颈鳞状细胞癌中过表达可抑制肿瘤进展。又进一步利用免疫沉淀鉴定了水通道蛋白2(AQP2)、整合素β4(ITGβ4)和Septin 2(SEPT2)可能与该微肽相关。后通过酵母双杂交实验和qPCR等发现该微肽与AQP2存在直接相互作用，且该微肽的抑制作用可能与AQP2调控ITGB4和SEPT2有关。有文献报道ITGB4和SEPT2与细胞运动和肌动蛋白细胞骨架有关[29]，将上述微肽命名为MIAC。该研究通过激光共聚焦光谱学实验发现过表达MIAC或分别敲除AQP2、ITGB4、SEPT2可导致丝状肌动蛋白应力纤维显著减少。此外，分别敲除AQP2、ITGB4和SEPT2对头颈鳞状细胞癌细胞增殖和迁移有抑制作用。综上所述，MIAC是一种与头颈鳞状细胞癌进展密切相关的新型肽。

5 lncRNA编码肽与食管癌

食管鳞状细胞癌男性发病率较高，男女发病率和病死率有2～3倍的差异，且吸烟和性激素与食管鳞状细胞癌的预后相关[30]。近期一项研究发现，Y染色体上的一个肿瘤抑制基因与男性乳腺癌有关[31]。表明Y染色体编码的遗传物质可能与男性主导肿瘤有关。然而，目前还没有关于Y染色体相关的lncRNA参与食管鳞状细胞癌的研究报道。Wu等[32]通过查找数据库和qRT-PCR等寻找与Y染色体相关的在食管鳞状细胞癌中差异表达的lncRNA，利用Log-rank检验和Kaplan-meier生存曲线分析,得出只有LINC00278在食管鳞状细胞癌组织中显著下调，LINC00278低表达的食管鳞状细胞癌患者生存期明显短于LINC00278高表达的食管鳞状细胞癌患者。通过多变量分析，证实了吸烟及LINC00278低表达与食管鳞状细胞癌患者生存期较短有关。通过免疫荧光和Western blot等多种实验证明LINC00278可编码一个在男性食管鳞状细胞癌中内源性表达和下调的小肽。通过对该小肽进行功能实验等发现，该小肽抑制了转录因子YY1与雄激素受体的相互作用，故将其命名为YY1BM。随后该团队通过实验证实YY1BM通过AR信号通路降低了eEF2K的表达，并且YY1BM下调显著上调了eEF2K的表达，抑制了细胞凋亡，从而使食管鳞状细胞癌细胞更适应营养剥夺，并且吸烟减少了LINC00278的m6A修饰和YY1BM翻译。综上所述，LINC00278和YY1BM可以作为男性食管鳞状细胞癌潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

总之，现lncRNA编码肽在肿瘤中的研究处于探索阶段，其在不同肿瘤中的具体作用机制有待更进一步研究。相信在不远的将来，lncRNA编码的功能肽可在癌症诊疗和预后研究方面发挥重要作用。