褪黑素对细胞的影响和睾丸支持细胞的调控

冯 瑞，王子铭，李晓宇，郑 鹏，张贵学

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

在自然界，褪黑素是一种广泛存在的分子，由脊椎动物松果腺产生，还在细胞和组织中局部合成，使生物体的生理机能充分适应日常和季节性的需求。褪黑激素具有两亲性，还具有特定的作用机制和作用方式，广泛在生物体中发挥作用。褪黑素通过自身受体介导的G蛋白信号转导途径发挥生理功能，膜受体1和膜受体2实质都是G蛋白，已经在脊椎动物中得到鉴定。文章对褪黑素及其介导的信号通路及睾丸支持细胞的应用进行综述，以期对后续相关研究和生产提供帮助，奠定基础。

1 褪黑素

1.1 概述

褪黑素简称MT，别称抑黑素、美拉酮宁以及松果腺素等，是一种由松果腺产生的激素，属吲哚类，化学式是N-乙酰-5-甲氧基色胺，亲脂能力很强，溶于有机溶剂，容易受热失效。在生物钟、繁殖、免疫、消化、中枢神经系统、细胞抗凋亡、抗炎、抗氧化以及抗肿瘤方面具有广泛的生物学效应。褪黑素在不同种生物体内的含量和作用也不同，在动物体内，能使机体皮肤所含色素逐渐变浅，在体内的含量受到光照的影响，由松果腺体细胞分泌出的褪黑素属于内分泌激素，会进入血液；视网膜受到光照的作用会通过下丘脑影响褪黑素的分泌；褪黑素通过分布于不同部位的膜受体来调节血压、性行为、生殖活动、季节性繁殖调节、昼夜节律和入睡觉醒时间。褪黑素发挥作用大部分是通过激活受体及直接接触的作用[1-3]。

在1917年研究人员发现从牛的松果腺提取出的物质作用于蝌蚪，减淡了皮肤颜色，在1959年分离并鉴定出褪黑素。早先人们认为褪黑素是动物神经激素，直到1987 年在植物中提取出相同结构的物质，由此得知线粒体或叶绿体都能产生褪黑素[4-5]。

1.2 功能

褪黑素可以穿过细胞膜和核膜，作用于细胞。其主要功能：作用于生殖细胞、下丘脑和垂体、调节激素分泌和精子卵子发生；可以预防癌症的发展，如乳腺癌；通过刺激谷胱甘肽（GSH）的产生，从而调节H2O2酶的合成，清除活性氧（ROS），改善线粒体的质量，达到抗氧化作用；通过受体结合调节免疫器官和免疫细胞发挥抗炎作用；可以与核受体维甲酸受体/维甲酸Z 受体(ROR/RZR)家族结合，参与昼夜节律的调节；有防治肿瘤、促进损伤修复等重要功能；可以对其他激素进行直接或者间接的分泌调节，如卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）等；可以结合G蛋白偶联的膜受体（MT1和MT2）通过多种信号转导途径激活相应的信号通路，调控细胞相应的生理活动[6-8]。

1.3 受体

褪黑素受体的种类已经明确，有两类受体：核受体和膜受体。核受体包括RZR 和ROR，膜受体包括膜受体1（MT1）、膜受体2（MT2）和膜受体3（MT3）。MT1 和MT2 实质是G 蛋白，具有高亲和力，发挥作用时G蛋白发生偶联；MT3主要存在于非哺乳动物体内，在人体细胞中没有发现MT3 受体的存在，在仓鼠的肝脏、肾脏中有发现。研究表明，MT1存在于视网膜、生殖系统、乳腺、肝脏和肾脏等。在不同组织和细胞中MT1、MT2 和MT3 受体介导的信号通路有所不同[9-13]。

1.4 合成

褪黑素体内或体外合成受到的影响因素有很多，最重要的是光照，白天光照充足分泌减少，夜晚光照缺少则分泌增多。在此过程中，松果腺释放去甲肾上腺素，调节褪黑素的增多或者减少。另外，睾丸也能够合成褪黑激素。

1.4.1 体内合成褪黑素的途径 首先，松果腺体细胞从血液中吸取色氨酸。

其次，来自血液中的色氨酸经过色氨酸羟化酶（TPH）催化转化为5-羟色氨酸，后被磷酸吡哆醛和磷酸二甲酯脱羧产生5-羟色胺（即血清素），通过芳基烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）转化为N-乙酰血清素。

最后由O-甲基转移酶（ASMT）催化形成褪黑素，释放到松果腺的毛细血管中，并以更高的浓度进入脑脊液，然后运输到机体所需部位[4,15]。

1.4.2 体外合成褪黑素途径 体外可以由色氨酸通过一个简单的四步合成途径合成褪黑素，关键是需要足够的色氨酸。

第一步：同体内合成第一步一致；

第二步：5-HTP 由芳族氨基酸脱羧酶（AAD）被催化为5-羟色胺（5-HT）；

第三步：通过N-乙酰转移酶（NAT）使血清素（5-羟色胺）被乙酰化；

第四步：通过羟基吲哚-O-甲基转移酶（ASMT）催化羟基甲基化转化为褪黑素。

2 褪黑素对细胞的调控

2.1 增殖分化调控

褪黑素通过受体介导信号通路促进细胞的增殖分化调控。褪黑素可以介导Wnt/β-catenin信号通路、mTOR信号通路和MAPK信号通路[16]。

Wnt/β-catenin信号通路激活后参与调控细胞的增殖分化，主要是MT2发挥作用。c-myc是一种可使细胞大量增殖和促进细胞分化的基因，也是该信号通路直接作用的下游靶基因。MT2抑制糖原合酶3磷酸化，使β-链蛋白聚集到一定程度，浓度会逐渐增加，此时会向细胞核内转移并与转录因子结合，促进c-myc转录，达到调控细胞增殖分化的目的[17-18]。

mTOR 信号通路中最重要的是雷帕霉素靶蛋白，它是一种保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，复合物有两种，分别是mTORC1 和mTORC2。活化后的mTOR 在细胞增殖、分化及代谢等方面发挥关键的调控作用。激活PI3K/Akt/m TOR信号通路会促进细胞增殖分化，这是一个主要途径[19-20]。

MAPK信号通路参与很多调控，如增殖、应激、生长、发育、分裂、炎症等，属于酶级联反应。调控细胞增殖分化主要是通过胞外调节蛋白激酶（ERK）发挥作用。

2.2 抗凋亡调控

在细胞中，细胞凋亡是一种主动进行的程序化死亡，是正常增殖分化的细胞受到某些基因的调控导致。

细胞凋亡存在内外两种途径，细胞内途径是通过线粒体凋亡途径调控，细胞外途径是通过细胞死亡受体介导的途径调控。这两种途径最后都会由半胱天冬氨酸蛋白酶家族的激活而促进凋亡基因转录和翻译，从而调控细胞凋亡[21]。

褪黑素可以介导胞内和胞外信号通路，缓解细胞凋亡。

2.2.1 细胞外途径 外源性凋亡途径是通过启动依赖Caspase酶级联反应的细胞凋亡过程，是一种通过蛋白互作的信号通路，直接调控细胞凋亡。肿瘤坏死因子受体是死亡受体，存在一种结构域，实质上是死亡结构域，它能与配体特定结合，激活凋亡信号通路，如Fas/Fas L[22]。

信号通路激活以后，Fas 受体活化，并快速与细胞质中相关的死亡结构域蛋白结合，这类蛋白既能与Fsa 相结合，也可以聚集半胱天冬酶8 酶原，形成“Fas受体-死亡结构域蛋白-半胱天冬酶8酶原”结合体，当大量的结合体聚集，导致局部浓度上升，此时半胱天冬酶8酶原会在复合体中催化形成具有活性的半胱天冬酶8，迅速激活下游因子，启动酶级联反应，调控细胞凋亡。

褪黑素作用以后，Fas 和Fas L 基因表达量显著下调，“Fas受体-死亡结构域蛋白-半胱天冬酶8酶原”结合体形成减少，同时凋亡蛋白表达也降低，膜通透性改变，线粒体细胞色素C 释放减少。这种调控还会抑制下游Caspase家族因子的激活。综上所述，褪黑素抑制Fas/Fas L 信号活性和Caspase家族蛋白的表达[23]。

2.2.2 细胞内途径 细胞在机体中也会受到很多不利的刺激，如机体内缺氧、新陈代谢紊乱、凋亡基因激活、DNA受损等，这些因素会直接影响细胞稳态，导致线粒体损伤、膜电位失衡、通透性改变和凋亡因子产生，最终激活线粒体凋亡途径[21,24]。

细胞内最主要的凋亡途径就是线粒体凋亡。当线粒体凋亡途径被激活时，通过调节凋亡蛋白翻译和基因转录发挥作用，控制线粒体膜的通透性，最终调节线粒体细胞色素C的释放。

线粒体基质可以合成褪黑素，外源补充的褪黑素也会集中在线粒体中。褪黑素可刺激抗氧化酶，使沉默调节蛋白3（SIRT3）水平升高。外源性褪黑素会通过寡肽转运蛋白进入线粒体，通过影响解偶联蛋白（UCP）影响线粒体膜电位。而且基质中的褪黑素可能会从线粒体中泄漏出来，与受体相互作用，控制细胞色素C的释放，减少促凋亡蛋白的表达，保证DNA 分裂正常，减少细胞的凋亡[25-26]。

2.3 抗氧化调控

在哺乳动物细胞中，内源性的ROS 主要来源是线粒体，ROS通过线粒体电子传输链不断生成，在正常的生理条件下内源性抗氧化剂（如GSH）清除ROS，以维持氧化稳态。由于细胞中ROS 含量不平衡而产生氧化应激，褪黑素可以保护线粒体正常工作和完整性，抑制ROS 的产生，维持稳态，减少氧化应激发生。

褪黑素对生理或压力相关条件下线粒体损伤和ROS 产生的影响具有积极作用，在生理条件下褪黑激素通过受体的结合或与信号调节因子相互作用，短暂刺激少量ROS的产生，以维持参与该激素的合成代谢。

由于快速的新陈代谢或衰老给予细胞压力，褪黑素通过保护膜电位和ATP水平防止线粒体损伤。以这种方式，褪黑激素限制ROS的量，使其维持在与最佳控制稳态过程相适应的水平，达到抗氧化作用。褪黑素缓解氧化应激的通路不止一条，还有如ERK、MAPK/JNK和Nrf2/HO-1等[27-30]。

2.4 抗炎调控

褪黑素可刺激酪氨酸磷酸酶活性并降低丝裂原活化蛋白激酶、ERK、p38和JNK的磷酸化水平，抑制NFκB和MAPK信号通路的激活，维持细胞内抗炎因子和促炎因子的表达量，在细胞炎症的调节中发挥作用。

3 褪黑素对睾丸支持细胞的调控

3.1 增殖分化调控

褪黑素可以通过ERK信号通路调控睾丸支持细胞增殖分化。研究发现，加入1a000 nmol/L褪黑素处理48 h 后可激活ERK/抑制素α 亚基信号通路，ERK 的磷酸化水平上升，显著提升细胞活力，促进鸡睾丸支持细胞增殖；模拟体内环境条件下，在体外将褪黑素和离体山羊睾丸支持细胞共培养，使细胞外调节蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平升高，产生较多胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF），促进睾丸支持细胞增殖[31-32]。

3.2 抗氧化调控

褪黑素可以通过Nrf2/HO-1 信号通路调控对睾丸支持细胞氧化应激。研究表明，褪黑素可以有效缓解热应激导致的睾丸支持细胞氧化应激损伤，并恢复间隙连接和紧密连接[33]；在顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞氧化损伤时，丙二醛含量明显增多，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH 和过氧化氢酶（CAT）等指标显著下调。加入褪黑素以后，Nrf2/HO-1通路上的Nrf2、HO-1蛋白明显上调，解除顺铂对信号通路蛋白抑制作用，氧化应激指标恢复正常，这充分说明了褪黑素是抗氧化的良好治疗物[34]。

3.3 抗炎症调控

褪黑素可以通过NFκB 信号通路调控炎症反应，抑制细胞中促炎细胞因子IL-6、TNFα和IL-1β的表达。研究发现，DEHP 会使细胞NFκB 核易位，使炎症因子IL-1β和TNF-α 表达量显著上调，诱导炎症反应，通过加入褪黑激素可有效降低DEHP 诱导小鼠睾丸的炎症反应。由此可以看出褪黑素可用作减少雄性生殖系统内分泌破坏性化学物质的治疗药物[33]。

4 展望及总结

睾丸支持细胞是睾丸内非常重要的体细胞，对于繁殖非常有意义。大量研究已经表明，褪黑素对于其他细胞在各个方面有积极作用，但在睾丸支持细胞上的研究少之又少。通过以上综述来看，研究褪黑素对细胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化是非常有意义的，褪黑素对生殖相关细胞方面的研究还有待探索，尤其在信号通路方面和其他外源物质相互作用方面，可能不仅仅只存在一种信号通路发挥作用，多条通路关联或者相互调控；不同物种间存在相同或者不同的信号通路促进生殖相关细胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化。褪黑素在精子的产生、成熟、运动、品质、疾病和生殖相关内分泌有着不可忽视的作用。总体而言，研究表明褪黑素对睾丸功能和雄性生殖有重要影响，随着研究的深入，褪黑素的作用机制会更加深入完善，将会为畜牧生产实践中褪黑素的应用提供坚实的理论依据和基础。