超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉和鸡蛋中25种兽药残留

陈兴连，李 倩，王志飞，方海仙，李彦刚，李茂宣，邵金良

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量监督检验测试中心(昆明)，云南 昆明 650205；2.云南省渔业科学院，云南 昆明 650051)

随着畜禽养殖业呈集约化、规模化、商业化、高密度发展，畜禽病害呈现高频化、复杂化趋势，为降低发病与死亡带来的经济损失，兽药被广泛用于预防和治疗畜禽疾病，或以亚治疗剂量添加于饲料中以促进动物生长、改善动物产品品质和提高饲料利用率[1]。但部分畜禽养殖场人员缺乏对药物危害的认知及科学用药的指导，或受经济利益驱使，不合理用药，甚至非法滥用各类兽药，且不严格遵守休药期[2-5]，导致畜禽产品中兽药残留超标现象时有发生。无论兽药残留水平高低，通过长期的食物链蓄集到一定量后会对人体产生毒副作用，如过敏反应，泌尿系统、生殖系统、心肌损害等，某些药物还具有潜在的致畸性、致癌性，或致休克甚至死亡[6-8]。此外，病原菌在长期接触这些低浓度药物后，容易增加病毒的耐药性及变异的可能性，从而减弱人类疾病的治疗效果，使公共卫生面临严峻的挑战和威胁[9-12]。兽药残留还会使畜禽产品出口受阻，影响畜禽业的健康持续发展和国家的经济发展。因此，开展兽药残留的检测研究，规范用药，以指导生产，保障食品安全，提高人民健康水平，增强畜禽产品的市场竞争力。

目前，兽药残留的检测方法有酶联免疫法[13]、生物法[14]、电化学法[15]、气相色谱法[16]、高效液相色谱法[17]及高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[4-8]等。其中，生物法和酶联免疫法的检测结果容易出现假阳性；高效液相色谱法和气相色谱法的灵敏度低、选择性差，且多集中于单一种类兽药的分析，完成一个样品中多类药物测定需采用不同的方法，前处理过程耗时、繁琐，检测低效高价；超高效液相色谱-串联质谱法具有高通量、高选择性、高分离度、高灵敏度、高检测效率等优势，是兽药多残留检测的首选方法[18]。鸡蛋、鸡肉样品基质复杂且兽药大多为微量甚至痕量残留，而国家要求的残留限量较低，给检测工作带来巨大挑战。虽然兽药多残留检测已有较多文献报道[19-22]，但未见同时测定鸡蛋和鸡肉中磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、金刚烷胺类兽药残留的报道。

本研究拟建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋和鸡肉中磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类和金刚烷胺类兽药残留，希望为禽类产品中兽药残留的检测提供有效手段。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

1290超高效液相色谱仪、ZORBAX C18色谱柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)：美国Agilent公司产品；QTRAP 5500三重四极杆/线性离子阱质谱仪：美国AB Sciex公司产品；涡旋振荡器：美国Thermo Scientific公司产品；JD200-2电子天平：沈阳龙腾电子有限公司产品；TGL-15 B型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂产品；旋转蒸发仪：德国海道尔夫公司产品。

1.2 样品与试剂

磺胺二甲异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁林、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噻二唑、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星、金刚烷胺、金刚乙胺、金刚烷胺-D15(10 mg/L)，恩诺沙星-D5、诺氟沙星-D5、环丙沙星-D8、磺胺邻二甲氧嘧啶-D3、磺胺间二甲氧嘧啶-D6、氯霉素-D5溶液标准物质(5 mg/L)，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素溶液标准物质(100 mg/L)：均购于农业农村部农产品质量标准研究中心；甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸：色谱纯，美国Sigma公司产品；无水硫酸钠、乙酸铵、氯化钠、正己烷、环己烷、盐酸(优级纯)、氨水(分析纯，含量25%～28%)、磷酸氢二钾(分析纯)：上海国药集团产品；PSA、C18填料(50 μm)：中国迪马科技公司产品；二甲亚砜：分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司产品；实验用水：自制超纯水。

1.3 溶液配制

用甲醇稀释各兽药溶液标准物质：金刚烷胺、金刚乙胺、氯霉素配制成0.1 mg/L，喹诺酮类、磺胺类、甲砜霉素、氟甲砜霉素配制成1.0 mg/L，7种内标均配制为0.5 mg/L贮备液，于4 ℃下避光保存。系列标准溶液用甲醇配制，现用现配。

0.2 mol/L盐酸溶液的配制：取1.5 mL盐酸(36%～38%)，用超纯水定容至100 mL。

1.4 样品前处理

1.4.1样品提取 称取5.00 g(精确至0.01 g)均质试样于50 mL塑料离心管中，加入30 μL 0.5 mg/L 内标溶液、5.0 mL盐酸溶液，涡旋至样品分散后，加15.0 mL乙腈和7～9 g氯化钠至溶液呈过饱和状态，涡旋提取5～7 min，以5 000 r/min离心5 min，取出乙腈层至50 mL离心管中，向残渣中加15.0 mL乙腈重复提取1次，合并2次提取液，待净化。

1.4.2样品净化 向上述待净化提取液中加入8～10 mL正己烷-环己烷混合溶液(1∶1，V/V)，涡旋1 min，以5 000 r/min离心5 min，取乙腈层浓缩至干，加入2.0 mL 0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解残留物，过0.22 μm滤膜后再将滤液蒸干，加入1.0 mL 0.2%甲酸-甲醇溶液复溶，待净化。

将30 mg C18和60 mg PSA吸附材料混匀，加入下端垫有滤纸的2.0 mL塑料医用注射器中，再加入2.0 mL 0.2%甲酸-甲醇溶液淋洗，除去淋洗液，将上述1.0 mL待净化溶液转移至净化柱，使其在重力作用下流出，接收净化液，过0.22 μm滤膜，待UHPLC-MS/MS测定。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 流动相：A为0.1%甲酸-水溶液(含0.1 mmol/L乙酸铵)，B为0.2%甲酸-甲醇溶液；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量2.0 μL；梯度洗脱程序：0.00～3.00 min(10%～40%B)，3.00～6.00 min(40%～95%B)，6.00～8.00 min(95%B)，8.00～8.20 min(95%～10%B)，8.20～10.00 min(10%B)。

1.5.2质谱条件 ESI离子源；离子源温度550 ℃；喷雾气(GS1)压力0.379 MPa；辅助加热气(GS2)压力0.379 MPa；气帘气压力0.241 MPa；正、负离子模式同时扫描，其中氯霉素类药物为负离子模式扫描，喷雾电压-4 500 V，多反应监测模式(MRM)；磺胺类、喹诺酮类、金刚烷胺类为正离子模式扫描，喷雾电压5 500 V，多反应监测模式，其他质谱参数列于表1。

表1 25种兽药及7种内标的质谱参数Table 1 Mass parameters of 25 veterinary drugs and 7 isotope internal standards

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1提取试剂的优化 本实验考察了4类兽药在乙腈和甲醇中的提取效果。结果表明，甲醇提取的样品中蛋白质、脂肪等杂质较多，后续净化难度增加且对目标物有较大干扰，大多数药物的回收率较差；而乙腈渗透性强，对多数目标化合物有较高的提取率，且沉淀蛋白质效果较好，可以减少强极性杂质和弱极性杂质的提取[23]，因此选择乙腈为提取试剂。

2.1.2样品水解液的优化 磺胺类、喹诺酮类药物在生物体内易与蛋白结合产生较强的结合力，影响药物的提取效率。若将乙腈直接加入高蛋白样品中会导致蛋白质急剧变性凝聚，使提取液不能充分接触药物，提取效率偏低。但在加入乙腈前先加入一定体积和浓度的酸或碱溶液，可破坏这一结合力和细胞结构，促使结合态药物解离为游离态，充分释放到提取液中，且水解后样品含水量增加还可减缓蛋白质的变性速度，增大提取试剂与药物的接触面积，提高药物的提取效率；另外，酸、碱还可抑制化合物酸、碱基团的解离，提高其转移到乙腈层中的效率。实验考察了向样品中加入相同浓度稀盐酸、氨水、甲酸、磷酸氢二钾溶液水解后药物的提取效果。结果表明，碱溶液水解的鸡蛋样品乳化现象较严重，乙腈与基质及水相难以分离；而酸水解的分层较好，其中加盐酸的样品中大多数药物的回收率更高，对盐酸浓度和体积优化后，确定以5 mL 2 mol/L盐酸水解样品。

2.1.3盐析试剂的优化 由于水解样品时带入大量水而影响提取试剂的浓缩效率。本实验考察了向提取液中加入过量的无水硫酸钠、无水硫酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠及氯化钠以除去水。结果表明，除氯化钠外，其余4种均不能使乙腈和水分层，无水硫酸钠及无水硫酸镁在本实验中的使用量不仅不能将水全部去除，还使部分兽药被吸附而降低回收率。而氯化钠的盐析作用可促使水相中的药物大量转移到乙腈层中，同时提取液中大量蛋白质沉淀于水相，避免了提取液浓缩时产生泡沫而溢出的损失。因此，向提取液中加入过量氯化钠至饱和(约7～9 g)，待乙腈和水分层后取出乙腈层再进行后续实验。

2.1.4提取次数的优化 本实验考察了鸡蛋、鸡肉样品水解后，每次加入15 mL乙腈分别提取1、2、3次后各药物的回收率，结果列于表2。可见，提取1次部分药物及相应内标物的提取效率有较大差异，部分药物超出兽药残留对回收率(70%～120%)的要求；提取2次的回收率最好；提取3次的干扰峰增多。因此，选择每次加入15 mL乙腈重复提取2次。

表2 样品提取1、2、3次后兽药的回收率Table 2 Recoveries of veterinary drugs after extracted of 1, 2, 3 times

2.1.5净化试剂的优化 提取液浓缩至干后，残留物中有大量油状物，因此先于提取液中加入8～10 mL正己烷除脂后测定。结果表明，大多数药物的回收率高于除脂前，且灵敏度增强，但磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、洛美沙星和培氟沙星的回收率较差。若使用8～10 mL环己烷-正己烷溶液，则磺胺间甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在70%～120%之内，其余药物的回收率也很好。因此，选择8～10 mL环己烷-正己烷溶液去除提取液中的脂肪。

此外，部分氯化钠溶于乙腈中，易对仪器造成污染。由于氯化钠在乙酸乙酯中的溶解度较小，因此，将样品提取液浓缩至干后，加入2 mL含不同浓度甲酸的乙酸乙酯溶解、过滤，考察对氯化钠去除效果及药物回收率的影响。结果表明，乙酸乙酯溶解后均有大量氯化钠析出，经0.22 μm有机滤膜过滤，去除氯化钠后大多数药物的回收率高于去除前，尤其是洛美沙星和培氟沙星，其中以0.2%甲酸-乙酸乙酯溶解的样品最好。通过计算样品提取液去除氯化钠前、后的药物基质效应(ME)(ME=空白基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%)发现，去除氯化钠后部分药物基质效应大大减弱，示于图1。由此推测，氯化钠对药物回收率有较大影响，选择0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解残留物去除氯化钠。

图1 除去氯化钠前(a)、后(b)，样品提取液中4类兽药的基质效应Fig.1 Matrix effect of 4 kinds of veterinary drugs in samples before (a) and after (b) removing sodium chloride

2.1.6净化方式的优化 样品中含有色素、糖、有机酸、矿物质等多种杂质，会减弱色谱柱的性能，影响仪器使用寿命。PSA可有效吸附糖类、色素、有机酸，C18可吸附脂肪和一些矿物质等，因此，实验将C18与PSA混合作为吸附剂，分别采用分散固相萃取法和改良分散固相萃取法(按1.4.2节操作)对经前两步净化后的提取液再净化。结果表明，由于改良分散固相萃取法中待净化液与填料接触更加充分，去除杂质效果更好，回收率较高，大多集中在80%～110%范围内。最终选择C18为30 mg，PSA为60 mg为吸附剂的改良分散固相萃取法对样品进行净化。

2.2 色谱和质谱条件的优化

2.2.1色谱条件的优化 多种兽药残留检测的流动相一般采用甲醇或乙腈为有机相，实验按1.5.1节洗脱程序对25种药物和7种内标物进行测定。结果表明，以乙腈为有机相时，部分药物或内标物响应比甲醇低，回收率也比甲醇差，所以选择甲醇为流动相的有机相。

H+能促进Q1四极杆内[M+H]+峰的形成，增加化合物在正离子模式下的离子化效率、分离度和响应强度；乙酸铵能提高化合物响应，改善部分药物的峰形。本实验在文献[24-28]的基础上，考察了含不同浓度甲酸、乙酸铵的水-甲醇溶液作为流动相的分离效果。结果表明，当使用0.1%甲酸水(含0.1 mmol/L乙酸铵)-甲醇溶液时，大多数药物的峰形、分离度和峰响应强度均最佳，但诺氟沙星的回收率大于120%，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率小于70%。经与药物标准品峰对比发现，样品中诺氟沙星-D5、磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的峰面积远远低于标准品。向甲醇中加入甲酸，随着甲酸浓度的增加，上述3种药物的峰面积逐渐增大，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率逐渐升高，诺氟沙星回收率降低。但由于正、负离子模式电离原理的区别，甲酸的加入会抑制负离子模式下化合物电离，导致峰响应值降低。为兼顾正、负离子模式同时测定时各药物的回收率与灵敏度，确定当流动相为0.1%甲酸水(含0.1 mmol/L乙酸铵)-0.2%甲酸甲醇时，25种药物回收率均达到最佳，批内、批间样品中各药物重复性最优，且氯霉素类检出限均低于GB/T 20756—2006要求。优化后的实验条件测定兽药混合溶液MRM色谱图示于图2。虽然大多数兽药峰重叠，但分别提取离子对后各物质峰形良好。

2.2.2质谱条件的选择 通过针泵以流动注射的方式对1.3节配制的标准溶液进行分析，为每个待测药物选取响应较高的2对离子对，为内标物选取响应最高的1对离子对，并优化相应的去簇电压和碰撞能作为最初的质谱参数。但在实际样品测试中，环丙沙星-D8响应最高的离子对峰受杂质峰的干扰严重，无法准确积分。以鸡蛋为例，其质谱图示于图3a，部分样品中杂质峰与恩诺沙星响应最高的离子对峰完全重叠，造成离子比率远远超出允许偏离范围，二者对定性和定量结果均有极大影响，通过调整流动相难以将杂质与目标物分离。因此，在满足灵敏度需求的前提下，对恩诺沙星优化出第三高响应离子对，环丙沙星-D8优化出次高响应离子对，示于图3b，相关参数列于表1。

注：a.磺胺类、喹诺酮类、金刚烷胺类；b.氯霉素类图2 4类标准品的多反应监测离子流色谱图Fig.2 MRM chromatograms of 4 kinds of standard solutions

2.3 方法学评价

2.3.1线性范围和检出限 根据每种药物在仪器上的灵敏度，以空白样品提取液作为溶剂，将4类药物配制成一系列质量浓度混合标准工作溶液，在优化的实验条件下测定，以药物峰面积与内标物峰面积比值(y)对被测组分的质量浓度(x)作图，确定25种药物的线性方程。在空白样品中加入系列低浓度25种兽药标准液，分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定检出限和定量限，列于表3。25种兽药在0.2～250 μg/L浓度范围内的线性关系良好(相关系数r>0.99)，检出限和定量限分别为0.1～0.9 μg/kg和0.3～3.0 μg/kg。

2.3.2回收率和精密度 根据混合标准溶液的浓度，分别添加约1倍(低)、5倍(中)、20倍(高)定量限浓度的25种标准溶液于鸡蛋和鸡肉阴性样品中，每个样品基质做6次平行实验，计算平均回收率及相对标准偏差，结果列于表4。4类兽药的平均回收率为79.5%～119%，相对标准偏差为0.9%～9.2%。

图3 样品中环丙沙星-D8响应最高离子对(a)及次高响应离子对(b)的质谱图Fig.3 Mass spectra of the highest (a) and highter (b) response ion pair of ciprofloxacin-D8 in eggs

表3 25种兽药的线性范围、线性方程、检出限、定量限、相关系数Table 3 Linear ranges, linear equations, limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and correlation coefficients of 25 veterinary drugs

续表3

表4 3个添加水平下，25种兽药在鸡蛋和鸡肉样品中的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 25 veterinary drugs in eggs and chicken at three spiked levels (n=6)

2.4 实际样品检测

使用本方法检测实验室采集的5份鸡蛋和5份鸡肉样品，以验证方法的可行性和准确性。结果表明，有1份鸡蛋中恩诺沙星含量为3.20 μg/kg，氟甲砜霉素含量为31.0 μg/kg，另有1份鸡蛋中金刚烷胺含量为1.80 μg/kg；有1份鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星含量分别为11.3、4.5、14.7 μg/kg。采用GB/T 21312—2007标准方法检测，鸡蛋中恩诺沙星含量为3.34 μg/kg，鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星含量分别为11.1、4.2、15.5 μg/kg；采用SN/T 4253—2015标准方法检测，鸡蛋中金刚烷胺含量为1.5 μg/kg；采用GB/T 20756—2006标准方法检测，鸡蛋中氟甲砜霉素含量为28.1 μg/kg。其他药物定性结果与标准方法一致，表明本方法准确性较好。

3 结论

本实验根据样品基质的特点和4类兽药的性质，对前处理方法及仪器分析方法进行了优化，建立了同时提取净化，超高效液相色谱-串联质谱法正、负离子模式同时扫描测定鸡蛋、鸡肉中4类25种兽药残留。该方法前处理简便、高效、回收率高、重复性好、成本低，一次测定即可完成4种标准方法才能完成的工作量，且对阳性样品的检出结果与标准方法得到的结果一致，对多种类兽药的检测具有借鉴意义，可为实验室日常检测、禽类产品质量安全隐患排查及政府监管提供技术支持。