苍耳子散对变应性鼻炎小鼠炎症及AQP5蛋白表达的影响

沈 明 黄小强

1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2.黄河科技学院医学院，河南 郑州 450063

变应性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)，即过敏性鼻炎，是指特异性个体接触变应原后由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病，主要临床表现为鼻塞、鼻涕、喷嚏和鼻痒，是临床最为常见的变态反应性疾病之一[1-2]。近几十年来，随着环境污染，饮食习惯、营养结构和体质变化等因素的影响，AR的发病率在全球范围内呈上升趋势，当前已影响全球10%～25%的人群[3]，被视为“21世纪的流行病”。AR属于中医学“鼻鼽”的范畴，中医药治疗本病多采用辨证论治，辨证以虚寒为主，治法以温补居多，疗效尚不满意[4]。因此，寻找有效防治变应性鼻炎的中医药是重要的课题之一。

苍耳子散源记载自宋代的《济生方》中：“辛夷仁半两，苍耳子两钱半，香白芷一两，薄荷叶半钱，上晒干，为细末，每服两钱，食后用葱、茶清调下。”方中苍耳子味甘入肺，具有发汗通窍，散风祛湿之功，同时能使清阳之气上升；辛夷味辛入肺胃经，具有通肺窍、散风寒之功；薄荷辛散祛风，白芷辛温通窍，诸药共奏疏风止痛、利鼻通窍之功。历代医家青睐苍耳子散治疗鼻渊、鼻鼽等疾患，每每奏验。本实验通过建立小鼠变应性鼻炎动物模型，探讨苍耳子散对其治疗作用及其可能存在的机制，为苍耳子散对变应性鼻炎的治疗作用提供药理依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级KM雄性小鼠60只，体重(20±2)g，6周龄，购自上海史莱克实验动物有限公司。实验动物许可证号：SCXK(沪)：2017-0005，动物合格证编号：20170005006012。适应性饲养 7 d 后实验，小鼠分笼饲养，室温维持22～26 ℃，相对湿度55%～65%，昼夜循环，保持12 h光照。

1.2 试药与仪器

1.2.1 药物 氯雷他定片(上海先灵葆雅制药公司)；苍耳子散(苍耳子6 g、辛夷9 g、白芷9 g和薄荷1 g，每剂)；给药前，将1剂苍耳子散加入30 mL蒸馏水煎煮至2 g/mL的母液，备用。

1.2.2 试剂 OVA(Sigma公司)；AL(OH)3(国药集团)；IgE、IL-5、IL-4、IFN-γ、HIS和IL-10ELISA检测试剂盒(上海西唐科技有限公司)；AQP5抗体(SantaCruz公司公司)；β-肌动蛋白(β-actin)；二抗羊抗鼠和羊抗兔。

1.2.3仪器 多功能酶标仪(奥地利Infinite公司)，高速台式冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，DHP-9052电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，BS-3000A系列电子天平(上海友声衡器有限公司)，垂直电泳槽、多功能成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 AR造模[5-6]将60只小鼠适应性饲养 3 d 后，随机分成正常组、模型组、氯雷他定组、苍耳子散低剂量组、苍耳子散中剂量组、苍耳子散高剂量组，每组10只。除正常组外，其他各组均于第0、7、14天腹腔注射 300 μL 含25 μg OVA、1 mg 氢氧化铝的PBS基础致敏，正常组腹腔注射等体积的PBS。从第21天开始用注射器取浓度为 25 mg/mL 的 OVA溶液滴鼻局部刺激，每侧滴注20 μL进行激发，正常组滴注等体积的PBS。共计滴注7 d，在第30天摘眼球取血后，脱颈椎处死小鼠，取材。

1.4 给药 在造模第14天开始灌胃给药，依据人与动物实验剂量换算公式，氯雷他定组给予20 mg/kg的氯雷他定药液(氯雷他定加入0.9%氯化钠注射液配制为1g/mL药液)。苍耳子散低、中、高剂量组分别灌胃3、6、12 g/kg的苍耳子散药液，模型组和正常组小鼠灌胃等剂量生理盐水，每日1次，连续灌胃14 d。

1.5 观察指标

1.5.1 苍耳子散对AR小鼠行为学指标的观察[7]各组均于末次给药后立即对小鼠挠鼻、打喷嚏行为进行观察，累计10 min，并记录各组小鼠挠鼻和打喷嚏次数。

1.5.2 苍耳子散对AR小鼠脏器指数的影响 小鼠处死后，取其脾脏、胸腺，称重后计算其脾脏、胸腺指数。

脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)

胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)

1.5.3 相关指标检测 小鼠取血后，3000 r/min 4 ℃ 条件下离心10 min，取上清，采用ELISA法检查血清IL-10、HIS、IL-5、IgE、IFN-γ及IL-4含量，具体步骤依据试剂盒说明书进行。

1.5.4 AQP5蛋白检测 取小鼠鼻腔粘膜组织，采用液氮研磨法，以1∶10比例(0.1 g组织：1 mL裂解液)，12000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量，制备样品，采用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制备10%的分离胶和5%的浓缩胶，上样，电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后加一抗，其中内参1∶5000，其他抗体 1∶1000，过夜，TBST冲洗3次，加入二抗1∶5000，TBST冲洗3次，ECL发光液显影。

2 结果

2.1 苍耳子散对AR小鼠行为学的影响 打喷嚏、挠鼻、流鼻涕是AR患者的三大症状，打喷嚏、挠鼻的次数可以反应AR的严重程度。与正常组相比，模型组小鼠挠鼻次数和打喷嚏次数明显增加(P<0.01)，表明OVA能够显著性升高小鼠挠鼻次数和打喷嚏次数。与模型组相比，苍耳子散各剂量组均能够减少小鼠挠鼻次数和打喷嚏次数，其中中剂量和高剂量具有显著性(P<0.05，P<0.01)。因此，根据小鼠挠鼻次数和打喷嚏次数情况，苍耳子散能够缓解AR小鼠鼻炎的症状。见表1。

表1 苍耳子散对AR小鼠挠鼻、打喷嚏次数的影响

2.2 苍耳子散对AR小鼠体质量及脏器指数的影响 各实验组小鼠体质量在实验初始阶段，无统计学差异(P>0.05)；终末体质量，与正常组相比，模型组小时体质量显著性降低(P<0.01)；与模型组相比，苍耳子散各剂量组小鼠体质量均增加，其中高剂量组体质量增加具有显著性(P<0.05)。见表2。

与正常组相比，模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数均明显升高(P<0.01)，提示，OVA能够显著性升高小鼠脾脏指数和胸腺指数；与模型组相比，苍耳子散组各剂量均能够不同程度降低脾脏指数和胸腺指数，其中中剂量组能够显著性降低脾脏指数，中剂量和高剂量组能够显著性降低胸腺指数(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表2 苍耳子散对AR小鼠体质量的影响

表3 苍耳子散对AR小鼠脾脏重、胸腺重及其脏器指数的影响

2.3 苍耳子散对AR小鼠血清中IL-4、IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中IL-4含量显著性升高，而IFN-γ含量却显著性降低，其IFN-γ/IL-4也显著性降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，苍耳子散各剂量组能够不同程度降低IL-4含量，其中中剂量和高剂量组显著性降低(P<0.05，P<0.01)，苍耳子散各剂量组能够不同程度升高IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4比值，其中高剂量组中IFN-γ含量及中剂量组和高剂量组中IFN-γ/IL-4比值显著性降低(P<0.05，P<0.01)。详见表4。

表4 苍耳子散对AR小鼠血清中IL-4、IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值的影响

2.4 苍耳子散对AR小鼠血清中IgE和HIS含量的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中IgE和HIS含量均显著性升高(P<0.01)；与模型组相比，苍耳子散各剂量组均能够不同程度降低IgE和HIS含量，其中中剂量和高剂量组均能够显著性降低IgE和HIS含量(P<0.05，P<0.01)。见表5。

2.5 苍耳子散对AR小鼠血清中IL-5和IL-10含量的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中IL-5和IL-10含量均显著性升高(P<0.01)；与模型组相比，苍耳子散各剂量组均能够不同程度降低IL-5和IL-10含量，其中中剂量和高剂量组均能够显著性降低IL-5和IL-10含量(P<0.05，P<0.01)。见表6。

2.6 苍耳子散对AR小鼠鼻黏膜组织中AQP5蛋白表达的水平影响 与正常组相比，模型组小鼠鼻黏膜组织中AQP5蛋白表达水平显著性降低(P<0.01)；与模型组相比，苍耳子散各剂量组均能够不同程度降低AQP5蛋白表达水平，其中高剂量组能够显著性降低AQP5蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01)。如图1所示。

表5 苍耳子散对AR小鼠血清中IgE和HIS含量的影响

表6 苍耳子散对AR小鼠血清中IL-5和IL-10含量的影响

图1 苍耳子散对AR小鼠鼻黏膜组织中 AQP5蛋白表达水平的影响

3 讨论

AR为临床多发病，对患者的生活质量造成了严重影响，使患者工作与学习效率下降[8-9]。过敏性鼻炎是鼻黏膜接触过敏原后由IgE介导的Ⅰ型超敏反应，以鼻痒、打喷嚏、鼻黏膜肿胀及鼻分泌亢进等为主要临床症状。近年来，由于受空气污染等因素的影响，过敏性鼻炎发病率逐年升高，是一种严重影响患者生活质量的疾病[10-11]。

临床常用的抗变应性鼻炎的药物主要有抗组胺药、过敏反应介质阻滞剂、糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂和免疫调节剂等[12]。通过实验发现在一定时间内观察AR动物的喷嚏次数和挠鼻次数能够较为直观的反应药物对AR的治疗作用。结果表明，苍耳子散灌胃后，能够明显减少AR小鼠的喷嚏次数和挠鼻次数。

变应原进入机体后，刺激机体产生特异性的IgE抗体，并通过Fc段与具有相应IgEFcεR的MC或嗜碱性粒细胞结合，促使免疫细胞脱颗粒，以及释放生物活性物，例如组胺、激肽原酶等[13]，从而引起过敏性鼻炎。研究结果发现苍耳子散能够显著性降低AR小鼠血清中HIS和IgE的含量，提示苍耳子散可通过抑制HIS和IgE的分泌缓解变应性鼻炎症状的目的。

在变应性鼻炎反应中，Th0细胞分化成Th1和Th2细胞，并产生不同的细胞因子，其中Th1细胞主要分泌IFN-γ，Th2细胞则大量分泌IL-4、IL-5、IL-13和IL-10等细胞因子[14]。IFN-γ可以抑制嗜酸性粒细胞在气道的浸润，在变应性鼻炎反应中起负调节作用[15]。IL-4是Th2细胞的特征细胞因子。IL-10是由单核细胞产生的抗炎细胞因子，少部分由淋巴细胞产生。IL-5在EOS的分化、成熟、黏附、浸润和凋亡过程中发挥极其重要的作用[16]。研究发现苍耳子散能够降低AR小鼠血清中的IL-4、IL-5和IL-10的含量，同时上调INF-γ的含量及INF-γ/IL-4比值。提示苍耳子散可通过调节Th1和Th2细胞因子的分泌来调节Th1/Th2的平衡，从而抑制AR小鼠的炎症反应。

水通道蛋白(Aquapcriins，AQPs)是一组与水液转运有关的细胞膜转运蛋白，它在体内液体转运和大多数腺体分泌方面具有重要作用。目前在鼻腔黏膜中发现有AQP1、AQP3、AQP4和AQP5，而AQP5在鼻黏膜中的分布和表达异常是导致水液输布和转运障碍的一个重要环节，是维持AR高分泌状态的原因之一[17]。研究发现苍耳子散能够增加AR小鼠鼻腔组织中AQP5蛋白表达水平。

综上所述，苍耳子散对变应性鼻炎的具有治疗作用，其作用机制可能与调节Th细胞分泌细胞因子及AQP5蛋白表达有关。