慢性HBV感染相关性肝癌发生的突变基因研究

何倩玉 李俊峰 毛小荣

一、前体蛋白

(一) preS1 慢性HBV感染是肝细胞癌(HCC)发生的主要原因。不同的preS/S突变体诱导不同的肿瘤发生机制，如转录因子的反激活和免疫炎症反应，从而导致HCC的发生。研究发现HBV病毒可刺激肿瘤干细胞(CSCs)相关标记(CD133、CD117和CD90)和CSCs相关基因(Klf4、Sox2、Nanog、c-Myc和Oct4)的产生，并促进人肝癌细胞CSCs的自我更新。HBV介导的CSCs生成需要HBV的PreS1蛋白。PreS1可激活正常肝细胞来源的细胞系(L02)和人肝癌细胞系(HepG2和Huh-7)中CD133、CD117和CD90的表达，促进L02细胞更新，提高L02细胞和HepG2细胞诱导肿瘤的能力[1]。为了能更好地研究有关HCC肝脏疾病的进展，研究者们建立了一个可以表达带有W4P基因突变的完整HBV基因组的转基因小鼠模型。结果显示，携带W4P基因的雄鼠肝肿大更明显，肝组织颗粒明显增多，肝脏和血清HBsAg升高，血清ALT和IL-6也升高。表明preS1中的W4P突变基因可能导致男性HBV病毒复制增加和IL-6介导的炎症增强，从而导致个人对HCC易感性存在性别差异[2]。另外，Pre-S1 A2962G/C2964A和Pre-S2 C105T突变体导致HBV cccDNA水平显著升高，而A2962G/C2964A突变体与AFP水平升高相关[3]。还有研究发现，rtF221Y和sR122K与HBV相关HCC复发有关。特别是rtF221Y可以作为预测HCC预后的病毒标志物。为了降低HBV DNA的复制，且预防耐药，有必要及时、慎重地选择核苷(酸)类似物(NAs)治疗。这有助于降低HBV相关HCC患者的复发率和提高术后生存率[4]。因此，PreS1作为一种新的癌蛋白，在HCC发展过程中发挥关键作用，这将有助于揭示HBV相关HCC的病毒学特征，实施更加个性化的临床诊疗，并改善疾病预后。

(二)preS2 最近一项研究表明，HBsAg大表面蛋白(LHBs)通过诱导肝细胞DNA损伤和PLK1介导的G2/M检查点失效，诱导细胞分裂失败，进而导致非整倍体形成，从而促进HCC的发展。LHBs诱导的细胞分裂失败可能是HCC发展的启动因素[5]。与HBsAg不同的是，PreS2中的大形态表面蛋白(LHBS)，其主要表达于HBV诱导的HCC肿瘤区域，提示其在肿瘤进展中发挥独特作用，血清中preS2突变体的相对水平于肿瘤分期是独立因素，是原发性肝癌切除术后再次复发的重要高危标志物[6]。人们还发现HBsAg的过度表达，包括大(LHBs)、中(MHBs)和小(SHBs)表面蛋白促进了HCC细胞的增殖和肿瘤形成，同时敲除HCC细胞中的HBsAg可降低IL-6的生成，抑制信号转换器和转录激活因子3 (STAT3)信号传导，IL-6-STAT3通路可能与HBsAg介导的HBV相关性HCC的恶性程度相关[7]。甲胎蛋白(AFP)和Glypican 3 (GPC3)在HCC中均为癌基因并被重新激活。实验中，在preS2阳性的HCC标本中AFP及GPC3水平显著高于preS2阴性的HCC标本，而白蛋白水平无明显差异。说明preS2蛋白的表达与HCC标志物AFP和GPC3密切相关[8]。HBV转录激活的FOXP3基因，编码了preS2癌蛋白，进而发生HCC；另外，ATAD2可能在HCC发生过程中发挥重要作用，并可能导致肿瘤的恶化。临床上，ATAD2的检测可作为肝脏活检组织鉴别病变性质的有价值的标志物[9-10]。

二、HBV x基因(HBx) 特定基因的基因突变是致癌和肝细胞癌进展的关键因素。然而，导致HCC发生、发展和生存预后的基因尚不清楚。大多数HCC患者的HBV整合于HBx区域，TERT启动子、TP53、CTNNB1、HBV整合等基因的改变与HCC的发展密切相关，TERT启动子的突变与不良预后相关[11]。研究发现，HCC患者中LINC00152基因的表达明显高于癌旁非肿瘤组织，且与肿瘤大小、HBsAg及肿瘤数量呈正相关。体外实验中，在Huh-7和SM7721细胞中，HBx过表达后LINC00152基因上调，HBx沉默后表达下调。表明HBx增强了LINC00152的表达，抑制LINC00152基因点可以作为肝癌的治疗靶点[12]。HBV x基因区域的T1753V突变、PC区域的G1896A突变以及前体蛋白的协同作用，可显著增加C基因型CHB患者HCC的发生[13]。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是一种由36 kD催化组成的三聚体蛋白质磷酸酶亚基(PP2Ac)。PP2Ac的高表达与血清HBsAg及HBeAg、肝硬化、肝细胞癌中至差的分化程度、疾病晚期、肝内转移和早期复发相关。实验发现PP2Ac与HBx可直接相互作用。PP2Ac过表达可促进HCC细胞增殖、集落形成和肿瘤发生。PP2Ac的上调对HCC患者的总预后生存期有较差的影响，并可增强病毒的侵袭性，PP2Ac可能是HCC潜在的治疗靶点[14]。在HBV相关HCC组织和细胞中可检测到MiR-520e和EPH受体A2 (EphA2)，MiR-520e上调，EphA2则下调。实验表明在HBV感染的HCC中，MiR-520e的过表达通过抑制EphA2，阻断p38MAPK和ERK1/2信号通路，从而减少HBV复制，抑制肿瘤细胞生长[15]。

功能性LncRNA基因参与多种癌症的发生。关于HBV相关性HCC的遗传易感性，已经进行了一些全基因组关联研究(GWAS)。多种单核苷酸多态性(SNPs)，如STAT4位点的rs7574865，HLA-DQ位点的rs9275319，8p12位点的rs12682266、rs7821974、rs2275959、rs1573266等，已被发现与HCC的发生有关[16]。研究选取的SNP中，rs12427129和rs3816153、rs2723175和rs2708973，可能在对HCC的易感性上发挥重要作用；rs2723176、rs2723175、rs2723186、rs364030、rs28947200、rs4392270 等与HBV的清除有相关性。尤其是rs4849133与HBV携带者和HBV相关性肝病进展相关[17]。

三、HBV病毒

牛磺胆酸钠的协同转运由SLC10A1编码的多肽(NTCP)是近年来研究的热点，认为SLC10A1 (NTCP) S267F变异与肝硬化、HCC风险降低以及抗HBV感染有独立相关性。研究中SLC10A1 (NTCP) S267F变异在排除性别、年龄、血清ALT和HBV DNA水平等重要危险因素后，与肝硬化、肝硬化HCC和非肝硬化HCC具有显著且独立的相关性[18]。

DNA双链断裂(DSBs)是细胞失活最严重的机制之一，因为它们可以阻断细胞周期的进展。DSBs可以发生在DNA复制过程中，也可以暴露于氧化应激、化疗或辐射之下。由于基因组不稳定和染色体易位，DSBs的积累可导致细胞凋亡。DSBs的修复经过两种细胞途径，即非同源黏性末端连接(NHEJ)和同源基因重组(HR)。肿瘤表达的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs),与肝癌患者的肿瘤进展、HBsAg载量和术后预后相关[19]。

典型的核因子jB (NF-jB)信号通路在HCC发生、发展中的作用取决于肝损伤模式，在HBV驱动的肝癌发生中，肝细胞中的NF-jB通过增强内质网应激反应而发挥重要的肿瘤抑制因子的作用[20]。

miRNAs 是一类约含 20～25 个核苷酸的非编码RNA，它可以通过与靶基因非编码区结合，从而影响基因的编码和稳定性。研究发现HBV感染合并肝癌患者肝脏中Let-7a水平明显降低，与肝内preS2 mRNA水平呈负相关。体内外研究表明，HBV miRNA抑制let-7a靶点，可增强HCC细胞集落形成和肿瘤生长，这为miRNA的致癌潜力提供了证据[21]。Let-7a miRNA可在各种癌症中显示下调。上调let-7a可减少HBV复制，并可预防HCC的发展，这一点可能是一种有效的治疗HBV感染的方法[22]。除此之外，血清 miR-375 和 miR-146a 在诊断上的敏感性和特异性均优于 CA19-9 和 AFP, miR-375 和miR-146a 可作为原发性肝癌,尤其是有HBV感染史患者原发性肝癌的诊断标志物[23]。

四、宿主免疫功能

HBsAg-toll样受体2(TLR2)通路对HBV相关HCC细胞生长和侵袭的影响，与HepG2细胞相比，HepG2.2.15细胞中TLR2的mRNA和蛋白水平明显升高。HBsAg增加了促炎细胞因子的产生和HepG2.2.15细胞的侵袭，而这一过程被TLR2所抑制。JS-K是一种释放一氧化氮的重氮庚二酸盐，对多种肿瘤有效，可抑制HepG2.2.15细胞生长，抑制细胞集落形成和迁移，阻滞细胞在G2期聚集，其作用机制不仅与抑制HBsAg和HBeAg分泌有关，还与诱导DNA损伤和凋亡有关。所以JS-K是一种很有前景的治疗HCC的候选药物[24-25]。另一项研究表明，高表达的HBsAg增强了与膜联蛋白II的相互作用。然而,膜联蛋白II不是跨膜蛋白。因此,通过TLR4 / 88 (MyD88) /骨髓分化因素NF-κB轴实现，某些方面HBsAg/GDPI复合物的机制激活了NF -κB通路。我们发现通过TLR4 / MyD88 /IκBαaxis的通路，HBsAg /β2 GDPI才可激活NF -κB信号通路，在HCC形成中发挥着关键作用在[26]。上述研究表明，TLR信号通路与慢性HBV感染期间的炎症和肿瘤进展有关，并也可通过BMI1和DKK1促进HBV相关HCC的进展[27]。

五、其他突变基因及通路

最近的证据表明，TIP30可能参与了上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的调控。细胞实验显示，HBV可能通过下调TIP30的表达来促进HCC的进展。TIP30在HCC中的下调可能是由HBV感染引起的，是影响HCC患者预后的独立不良因素[28]。研究表明，CASP8-652 6N ins/del多态性可能是中国汉族人群HBV相关HCC的风险和预后生物标志物，与HCC的发生、发展和预后生存中起着积极的作用[29]。有报道称，HBV rtA181T/sW172*突变体的出现可导致HBsAg显性分泌缺陷，增加HCC发生的风险。sW172*突变编码可能增加HBV相关性肿瘤发生的可能性，其机制可能与TGF- TGF /Smad信号通路中TGFBI表达下调有关。然而HBV突变体编码截断型HBsAg的确切生物学特性尚不清楚，截断型HBsAg增加HBV致瘤的确切机制尚需更多研究揭示[30]。

泛素-细胞色素c还原酶铰链蛋白(UQCRH)由线粒体呼吸的细胞色素BC1复合物组成。UQCRH在肿瘤较大、分化较差的肝癌细胞中高度表达，或存在侵袭血管。UQCRH过表达与HCC患者预后不良相关。此外，在以AFP升高为主的高危分组的患者中，UQCRH无过表达可能是临床治疗的参考指标[31]。

肝癌细胞中锌指抗病毒蛋白(ZAP)，ZAP的表达与凋亡信号通路相关。在HCC中ZAP低表达较为常见，与HCC进展及预后较差相关，在HCC的发生中起重要作用。还需要更多、更大样本量的临床研究来阐明HCC和ZAP表达之间的相关性，将ZAP确定为肿瘤抑制基因，并将其作为治疗HCC的新靶点[32]。

HBV与肝癌的发生有密切的联系，随着分子生物学及细胞生物学等先进技术的应用，在HCC发病机制方面的研究取得了一定进展,但缺乏突破性。以上研究对于进一步理解HBV的肿瘤发生机制非常重要，这些结果对于理解肝癌发生、诊断和预测HCC患者预后的潜在机制非常有用，并将为预防HBV相关肝癌的发生及其进展提供新的策略。