ATLI患者遗传易感性及新型生物标志物的研究进展

聂伟杰 刘家旗 张锦 孟存英

我国结核病负担较重，抗结核治疗过程中会出现各种不良反应，其中以抗结核药物性肝损伤最为多见，危害性也最大，也是我国药物性肝损伤(ATLI)的常见原因之一，位居第二，仅次于中药[1]。有诸多研究表明抗结核药物性肝损伤(ATLI)的发生与性别、年龄、基础疾病都有关，当然与遗传易感性也有密不可分的联系，但遗传易感性方面需要探索的方面仍有许多。诊断方面主要依靠RUCAM评分量表，RUCAM(Roussel Uclaf因果关系评估方法)是一种完善的诊断算法和标准，用于评估疑似药物性肝损伤患者的因果关系[2]。该算法提供了肝脏损伤与可疑病例之间高度可能、可能、不可能或排除关系的定量因果关系分级，但其对病历数据的完整性要求较高，且其为一种排除性诊断，因此以RUCAM为基础的可能病例和极可能病例对于检测新的生物标志物、确认新的诊断方法至关重要[3]。ATLI临床分型、病情严重程度分级以及治疗等方面研究比较清晰，本文主要对ATLI患者的基因多态性及RUCAM评分量表基础上对诊断有意义的生物标志物及其他诊断方法做一阐述，提高临床对ATLI的认知。

一、 ATLI患者的遗传易感性

ATLI是抗结核过程中最常见、最严重的的并发症，近年来越来越多的证据证明其与药物代谢强度的遗传多态性有关，遗传多态性主要体现在一些与代谢有关的酶系及转运体。ATLI患者的遗传易感性的探索有助于预测抗结核药物发生肝损害的概率。

(一)N-乙酰转移酶2(NAT2) N-乙酰转移酶2(NAT 2)是一种重要的代谢酶，参与药物代谢和解毒，基因多态性和DNA甲基化已被证明是影响NAT 2表达的关键因素[4]。有学者通过DNA测序来评估NAT2编码区的单核苷酸多态性，发现NAT2*6A与AT-DILI易感性显著相关，此外，结核患者和NAT2相关的慢乙酰化子表型患者比快速和中间型乙酰化子表型患者更易发生ATLI[5]。与NAT2慢乙酰化子表型患者相比，超慢乙酰化子表型患者更易发生ATLI[6]。另有学者研究蒙古族ATLI患者，发现NAT2基因481(rs1799929)和590(rs1799930)的多态性和乙酰化表型有显著差异，慢乙酰化型ATLI的发生率是快乙酰化型的3.56倍[4]。与对照组相比，ATLI组CpG5、CpG10、CpG11.12和NAT2启动子区总甲基化呈高甲基化状态，但经二元logistic回归分析，慢乙酰化、中间乙酰化和快速乙酰化均与ATLI无关，因此NAT2基因启动子区总甲基化是蒙古族ATLI患者的独立影响因素[4]。遗传多态性影响NAT2基因的表达速度，NAT2的慢乙酰化状态会增加ATLI发生的风险。

(二)细胞色素P450 2E1(CYP2E1) 细胞色素P 450 2E1是参与乙醇代谢的主要酶，其水平可能与药物的氧化速率有关，可以通过自由基的产生损害肝细胞，基因多态性影响着P450 2E1的表达[7]。对于CYP2E1 RsaI/PstI多态性，在基于种族和抗结核药物方案的亚组分析中，CYP2E1 RsaI/PstI c1/c1基因型肺结核患者患ATLI的风险显著增加[8]。

(三)谷胱甘肽S-转移酶(GST) 谷胱甘肽S转移酶(GST)作为药物解毒机制中的重要保护作用，可能影响患者对抗结核药物性肝损伤(ATLI)的易感性,GST分子基因多态性可引起酶分子结构、功能和水平的改变。有学者进行荟萃分析发现东亚人群中无GSTM1基因型与ATLI风险增加相关。无GSTT1基因型增加了ATLI的风险，尤以印度人最为突出。这项最新的荟萃分析强烈提示GSTM1和GSTT1多态性与ATLI的关联[9]。GSTP1 rs1695和GST启动子甲基化均与GSTP1基因的表达有关，可能与ATLI发生有关，rs1695和GSTP1的启动子甲基化可能独立地参与ATLI的发生[10]。

(四)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1) 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)是哺乳动物体内一种重要的结合酶，负责内源性和异生物化合物的结合和解毒[11]。其基因多态性影响着UGT1A1的表达，表达不足时会导致毒性物质堆积，可能导致ATLI。有学者研究发现UGT1A1基因rs4148323 A/A基因型能显著降低ATLI的发病风险，UGT1A1的ATG单倍型也降低了ATLI的风险，因此UGT1A1基因多态性与ATLI易感性有关，易感基因的分子鉴定为预测肺结核患者ATLI的发生率和预测治疗效果提供了理论基础[12]。

(五)溶质载体有机阴离子转运体家族成员1B1(SLCO1B1) 溶质载体有机阴离子转运体家族成员1B1(SLCO1B1)主要表达于肝细胞的基底膜，对肝脏摄取和清除多种药物底物和内源性化合物至关重要。一般来说，有机阴离子转运多肽(SLCO1B1)是一个摄取转运体的超家族，介导多种两亲性有机化合物(包括胆盐、类固醇结合物、甲状腺激素、阴离子肽、许多药物和其他异物)的钠无关转运。SLCO1B1是高度多态的，许多相关的和种族相关的多态已经被发现并进行了功能表征[13]。SLCO1B1基因型rs4149034 G/A、rs1564370g/C、rs2900478 T/A患者发生ATDH的风险显著降低，而rs2417957t/T和rs4149063t/T基因型患者发生ATDH的风险增加。相关研究发现UGT1A1的rs4148323 A/A基因型显著降低了ATDH的风险。单倍型分析显示SLCO1B1的TGTG、TTTC和GTTC单倍型与ATDH风险增加相关，而GACC单倍型与风险降低相关[12]。

(六)NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK基因多态性 抗结核药物的活性代谢产物可导致活性氧(ROS)过多，导致药物性肝损伤。NRF2是细胞氧化应激反应中的关键因子，受KEAP1、MAFF、MAFK调控，通过与抗氧化反应元件ARE相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达[14]。以中国抗结核治疗队列为基础，采用巢式病例对照研究，发现NRF2中携带TC基因型rs4243387或C-C单倍型(rs2001350-rs6726395)的患者发生ATLI的风险增加，而携带rs2267373的TC基因型或MAFF中C-G-C单倍型(rs2267373-rs4444637-rs4821767)的患者ATLI风险降低[14]。亚组分析还发现MAFF中rs4821767和rs4444637，MAFK中rs4720833与不同遗传模型下肝损伤的具体临床模式之间存在显著相关性，研究表明NRF2、MAFF和MAFK基因多态性可能与中国抗结核治疗人群对ATLI的易感性有关[14]。

(七)PXR和NF-κB1基因多态性 孕烷X受体(PXR)调节药物代谢酶和转运酶的表达,NF-κB不仅通过调节炎症反应在肝内稳态和损伤愈合过程中发挥作用，而且还可能调节PXR的转录[15]。有研究表明PXR中rs3814055的T等位基因与ATDILI风险降低相关，NF-κB1中rs78872571和rs4647992的T等位基因与ATDILI风险增加显著相关，因此其基因多态性与ATLI的发生相关[15]。

(八)其他 还有相关报道表明转化生长因子β1基因多态性、超氧岐化酶基因多态性等与ATLI发生相关，相关基因多态性的检测为肺结核患者发生ATLI提供了重要的预测及预后价值。

二、ATLI新型生物标志物

抗结核药物性肝损伤诊断主要依靠RUCAM评分量表，但其主要是一种排除性诊断，有一定的局限性，对病例完整度要求高，因此找寻具有诊断价值及预后评估的方法刻不容缓，下面将进一步阐述对ATLI有诊断价值的方法，进一步提高临床对ATLI的认知。

(一)白细胞端粒长度 端粒是在线性染色体末端发现的核蛋白结构，与细胞衰老有关，随着年龄的增长而缩短，与各种年龄相关的疾病有关,端粒长度作为疾病和/或疾病易感性的临床生物标记物的有效性和实用性引起了人们的极大兴趣[16]。有学者应用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RTL)对100例年龄和性别健康对照组、49例ATLI肺结核患者和53例非ATLI肺结核患者的白细胞相对端粒长度(RTL)进行了测定，与非ATLI患者相比，ATLI肺结核患者RTL明显升高，RTL延长与ATLI易感性增加显著相关[17]。多元线性回归分析显示，RTL的增加与抗结核治疗后60 d内评估的天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的升高独立相关[17]。Kaplan-Meier曲线分析表明，RTL时间越长，肺结核患者肝毒性发生率越高。受试者操作特征曲线分析揭示了RTL作为ATLI进展新指标的诊断准确性，该指标比传统肝脏生物标志物(包括抗结核治疗后7 d内测定的转氨酶活性)具有更高的敏感性和特异性,白细胞中异常的RTL反映了抗结核药物引起的肝毒性，可能是ATLI早期进展的潜在生物标志物[17]。

(二)人白细胞抗原B和人白细胞抗原DQB1联合5-羟甲基胞嘧啶 DNA甲基化被认为是调节基因表达的一种方法，它参与了许多生物学和病理过程，甲基群加在胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶，5-mC)的5碳位上，是最清楚的表观遗传机制之一[18]。有学者采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血白细胞DNA中5-mC和5-hmC的含量，单因素分析HLA-B和HLA-DQB1的5-mC和5-hmC含量与ADLI显著相关，受试者操作特性(ROC)分析表明，HLA-B和HLA-DQB1的5-hmC含量均高于5-mC含量。HLA-B和HLA-DQB1联合5-hmC水平是诊断ATLI的最佳指标，灵敏度和特异度均较高，可以作为ATLI患者的诊断指标[19]。

(三)MicroRNAs(miRNAs) microRNAs是一类小的单链内源性高度保守的非编码RNA，在细胞增殖、分化、肿瘤转化和细胞再生等多种细胞生理事件中起着重要的调控作用，众多研究发现证明了microRNAs表达与许多疾病的发展密切相关，表明microRNAs作为临床生物标志物和药物发现靶标的重要性[20]。目前生物标志物ALT/AST、ALP和TBil为DILI的诊断提供了一种无创的诊断工具，在疾病诊断中发挥着重要作用，但这些生物标记物的升高也见于一般性肝损伤，在肝损伤中只有进展后才会升高和检测到，miR-122与ALT/AST相比，作为早期预测因子具有更高的灵敏度和特异度[21]。有学者研究发现随着INH诱导肝损伤时间的延长，组织miR-122的表达水平在0.25 h(即INH的峰值浓度时间)明显低于对照组。其变化较血清转氨酶和miR-155变化快，0.75 h时显著升高，且病理评分与miR-122/miR-155比值相关，因此miR-122/155比值可作为ATLI的敏感生物标志物，有助于抗结核治疗后患者的早期诊断[22]。

(四)鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT) OCT是一种同三聚体线粒体酶，这种进化上保守的酶主要在肝脏和小肠中表达，与尿素代谢有关，据报道可以作为肝脏损伤的生物标志物[23]。所有受试药物均能观察到肝细胞损伤后OCT的释放，OCT的释放动力学明显大于ALT，与ALT不同，OCT的最大释放水平因受试药物而异，这些独特的释放特性突出了OCT可以提供一种有前途的DILI生物标记物的可能性，这不仅有助于提高诊断准确性，而且有助于更好地了解临床和药物开发环境中的毒性类型[24]。

(五)嗜酸性粒细胞参数 在DILI患者中，在丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高之前观察到平均嗜酸性粒细胞体积(MEV)和大小变异性(MEV-SD)的增加,治疗后MEV与ALT呈正相关,ROC曲线分析显示，与其他参数相比，MEV和MEV-SD曲线下面积较大,诊断灵敏度和特异度均高于DILI发生前的其他参数[25]。

综上，抗结核药物性肝损伤的基因多态性为ATLI的发生率和预测治疗效果提供了理论基础，新型诊断方法有助于完善ATLI的诊断。N-乙酰转移酶2(NAT2)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、溶质载体有机阴离子转运体家族成员1B1(SLCO1B1)、NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK基因多态性、PXR和NF-κB1基因多态性等均有依据证实与ATLI的发生有关。白细胞端粒长度、人白细胞抗原B和人白细胞抗原DQB1联合5-羟甲基胞嘧啶、MicroRNAs(miRNAs)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)、嗜酸性粒细胞VCS参数等均可作为有价值的生物标志物来诊断ATLI，但目前尚未广泛应用于临床。基因多态性及新型检测方法需要进一步探索，为临床提供更加全面的认识。