奶牛乳腺炎细胞模型的建立及中药治疗作用机制研究进展

申纪饶，武小虎，张惠婷，李新圃，丁学智，严作廷，李宏胜

（中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所／农业部 兽用药物创制重点实验室／甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050）

奶牛乳腺炎是一种由机体、病原微生物和环境卫生共同作用引起的奶牛常见病，发生范围广、发病率高，严重影响奶业的可持续发展［1］。全世界约有三分之一的奶牛患有各种类型的乳腺炎，而我国临床型乳腺炎发病率高达33.41%，隐性乳腺炎阳性率更高达46.4%～85.7%，均高于国外，给我国奶牛养殖业带来了巨大的经济损失［2］。

目前，兽医临床上主要采用抗生素防治奶牛乳腺炎，但抗生素的使用导致乳汁中的抗生素残留和病原菌耐药问题加剧，不仅危害了奶牛的健康，同时也影响了人们对绿色食品的追求［3］。中药以纯天然、资源丰富、低毒、低残留、药效明确、不易产生耐药性、绿色环保等优势，成为未来研究防治奶牛乳腺炎药物的发展方向［4］。

中药方剂的筛选及作用机制的研究通常需要建立相关的疾病模型，使用奶牛活体研究开发新药具有成本大、风险高且无法保证试验样本同一性的问题。而牛乳腺上皮细胞（bMEC）作为乳腺中唯一具有分泌功能的细胞，不仅是实现泌乳的基础，而且是通过乳导管与外界接触较紧密且具有免疫功能的细胞，是乳腺先天免疫的重要组成部分，与奶牛乳腺炎的发生有着密切联系。bMEC广泛分布在高度分支的乳腺实质组织表面，其数量远多于其他参与抵御侵入病原菌的免疫细胞，在乳腺免疫中扮演重要角色，可以成为乳腺免疫的哨兵，它的免疫功能也因此受到人们的极大关注［5］。研究表明，bMEC可以表达多种细菌传感器，即病原菌模式识别受体，可以识别病原体相关分子模式，进而产生免疫应答，释放IL-8、IL-1β、IL-6、TNFα、IL-17A等炎症介质，进行免疫防御［6-7］。由于bMEC的免疫特性，目前它已经广泛用于生理、病理、药理等方面的研究，以及研究泌乳机制、乳腺炎发病机制和药物筛选等，为奶牛乳腺炎的研究节约了成本、提高了效率。因此，文章就中药防治奶牛乳腺炎的研究现状、体外乳腺炎细胞模型的建立、中药干预奶牛乳腺炎细胞模型研究进展及其作用靶点进行综述，以期为奶牛乳腺炎的临床防治找到一种有效的解决措施。

1 乳腺上皮细胞的培养特性研究

从尊重生命和动物福利考虑，在药物研究初期应尽量减少实验动物和靶动物的使用；同时也为了避免体内试验周期长、成本高、条件复杂且存在个体差异等诸多问题，细胞试验成了研究者的首选。因此，建立乳腺上皮细胞体外分离培养体系是开展乳房炎致病机制研究及治疗药物筛选工作的基础。

1.1 小鼠乳腺上皮细胞

刘玉辉等［8］通过采取妊娠后期的健康SPF昆明鼠的乳腺组织，经胶原酶消化等一系列操作后成功分离到高浓度的小鼠乳腺上皮细胞，其形态呈铺路石样，细胞联系紧密，间隙清晰。高云航等［9］采取孕中期的健康小鼠，选用混合酶经差时消化法及传代培养、分离、纯化到铺路石样的乳腺上皮细胞，当细胞密度高时呈岛屿状生长，密度低时各细胞的凸起和细胞外基质形成拉网状结果。易琼等［10］利用改良过的混合酶（采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶混合（1∶1∶1））及差速贴壁法纯化培养乳腺上皮细胞，72 h后细胞完全铺开，呈典型的铺路石样。免疫荧光鉴定结果显示，角蛋白18呈阳性反应。方彧聃等［11］利用慢病毒载体，建立了稳定表达牛催乳素的小鼠乳腺上皮细胞系，为体外研究乳腺生物反应器提供了良好的细胞模型。刘玉辉等［8］培养的传代小鼠上皮细胞虽出现铺路石样外观，但细胞间隙大，排列不规则。

1.2 牛乳腺上皮细胞

利用牛乳腺上皮细胞进行奶牛乳房炎的体外研究试验更具可靠性。目前关于牛乳腺上皮细胞的获取有分离原代细胞和建立细胞系两种方式。

卢金霞等［12］采用组织块培养法和乳汁分离法分离培养奶牛乳腺上皮细胞，利用差时胰酶消化法纯化奶牛乳腺上皮细胞，通过测细胞核型及骨架蛋白-角蛋白，对分离的牛乳腺上皮细胞进行验证。结果在显微镜下观察可见，纯化的乳腺上皮细胞为典型上皮细胞形态，呈多角形或乳滴形，细胞核型正常，细胞特异性蛋白-角蛋白表达呈阳性，成功建立了奶牛乳腺上皮细胞模型。马鹏睿［13］应用组织块种植法和胰酶消化法分离培养牛乳腺上皮细胞，鉴定为牛乳腺上皮细胞，为后续黏附素ClfA、EfB及FnBPA的抗体对金黄色葡萄球菌黏附牛乳腺上皮细胞的抑制试验建立了基础。董海龙等［14］通过组织贴块法取部分奶牛乳腺组织进行培养，通过免疫荧光鉴定、形态学观察、扫描电镜和透射电镜检测原代乳腺上皮细胞特性，结果显示，分离到的牛乳腺上皮细胞呈鹅卵石样，呈单层聚集，细胞状态良好，培养至15代以上细胞增殖仍旺盛，可以作为奶牛乳腺相关研究重要工具。李胜利等［15］建立了一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞的培养方法，通过该方法，细胞能形成桥粒和紧密连接，为多种与奶牛乳腺相关的试验研究提供了体外细胞模型。

随着目前研究的深入，学者们不仅使用原代细胞进行研究，还旨在建立永生化的牛乳腺上皮细胞系。最常用的永生化方法包括病毒法、人端粒酶催化亚基法、引入癌基因或通过放射因素干扰细胞的衰老进程，损害其衰老机制，最终使细胞获得永生能力［16］。B.Zavizion等［17］利用SV40LTA转染至原代牛乳腺上皮细胞，从而建立了细胞系。这种细胞系表现出典型的上皮细胞特征，能稳定表达角蛋白、微绒毛、特殊乳白蛋白等。胡菡［18］通过一种携带SV40大T抗原基因的病毒感染原代牛乳腺上皮细胞，使其永生化，这种细胞能够稳定传代到50代并具有上皮细胞标志特征。He X.Y.等［19］通过重组腺病毒介导的人端粒酶逆转录酶基因建立了一种自发永生化的牛乳腺上皮细胞系，该细胞与原代细胞有同样的基本特征。这些细胞系的建立为奶牛乳腺炎的研究提供了坚实的基础。

2 牛乳腺上皮细胞炎症模型的建立

体外建立乳腺炎细胞模型不仅是研究细菌感染乳腺炎的基础，还可利用此模型进行药物筛选。病原微生物对细菌的感染主要分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌的主要成分，可被Toll-4受体识别，而脂磷壁酸（LTA）是革兰氏阳性菌致病的主要成分，可被Toll-2受体识别，二者均可诱导乳腺上皮细胞模拟细菌感染。因此，分别对细菌及LPS和LTA诱导乳腺上皮细胞建立炎症模型进行综述。

2.1 革兰氏阴性菌诱导

LPS是革兰氏阴性菌的主要成分，可以模拟革兰氏阴性菌感染。利用LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞建立模型，具有方便易得、价格低廉的优点，有助于深入研究该病的发病机制。郝俊芳等［20］以1，5，10μg／mL LPS处理小鼠乳腺上皮细胞48 h，结果显示，与空白对照相比，LPS刺激后小鼠乳腺上皮细胞与炎症相关的mRNA表达均呈现增加趋势，并表现出明显的剂量依赖性。Xiao H.B.等［21］用LPS处理小鼠及离体乳腺上皮细胞后发现，脂多糖在小鼠乳腺炎体内外模型中诱导炎症反应，并提示NF-κB通路和OPN参与其中。在利用山羊乳腺上皮细胞建立模型方面也有文献报道。O.B.Javier等［22］用1μg／mL LPS侵染山羊乳腺上皮细胞，结果CCL2、CXCL6、IL6、CXCL8、PTGS2、IFIT3、MYD88、NFKB1和TLR4的表达增加，该研究结果使人们对LPS刺激损害山羊乳腺组织的潜在机制有了一个基本的认识。

由于利用奶牛乳腺上皮细胞具有同源性，更受到学者们的认可。张文耀等［23］利用LPS对奶牛乳腺上皮细胞进行侵染，选用TNF-α作为建立乳腺炎细胞模型的指标，设置LPS浓度梯度0，5，10，20 ng／μL以确定最适浓度，然后根据推荐处理时间设置0，3，6 h，筛选最适浓度下能够明显上调TNF-α的最短处理时间作为建立模型的处理时间。结果显示，在0～10 ng／μL浓度范围内，LPS作用乳腺上皮细胞3 h，TNF-α基因表达水平和蛋白表达水平随LPS处理浓度的增高而增加。安东等［24］利用0，1，10，100μg／mL LPS分别处理细胞6，12，24 h后收集细胞，检测TNF-α的表达量。结果显示，LPS处理后TNF-α、IL-6、BNBD-5表达量增加，确定炎症模型建立成功。

由于大肠杆菌是目前引起奶牛乳腺炎的最主要革兰氏阴性菌，因此，为了更加真实地建立乳腺炎细胞模型，目前大多数学者还以大肠杆菌为研究对象。卢劲晔等［25］利用大肠杆菌侵染小鼠乳腺上皮细胞，大肠杆菌刺激原代培养的乳腺上皮细胞后TLR-4和MyD88蛋白表达显著升高，乳腺上皮细胞中促炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β的表达及活性氧（ROS）的释放均显著升高，成功建立了细胞炎症模型。于亚娟等［26］用热灭活的大肠杆菌作用于牛乳腺上皮细胞，发现大肠杆菌能促进TLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表达，其表达水平具有剂量和时间依赖性。Gu N.J.等［27］用热灭活的大肠杆菌（E.coli）感染原代牛乳腺上皮细胞时，发现几乎所有编码炎症趋化因子相关基因被显著激活，其中包括白细胞介素、β-防御素、血清淀粉样蛋白A和触珠蛋白相关的基因。

2.2 革兰氏阳性菌诱导的乳腺上皮细胞炎症模型

LTA是革兰氏阳性菌细胞壁的重要成分，能激发机体的炎症反应［28］。利用LTA刺激乳腺上皮细胞建立炎症模型，可以模拟革兰氏阳性菌感染，有利于深入研究革兰氏阳性菌在奶牛乳腺炎中的致病机制。

张文耀等［23］以0，1，10，20，40 ng／μL浓度梯度、以0，3，6，12，24 h时间梯度处理细胞，结果表明，20 ng／μL的LTA处理上皮细胞12 h可诱导乳腺上皮细胞发生明显的细胞免疫应答，为体外建立LTA诱导奶牛乳腺炎细胞模型的最适条件。Y.Strandberg等［29］用LTA诱导牛乳腺上皮细胞，发现IL-1β、IL-8、TNF-α、CXCL6和β-防御素mRNA表达显著增加，TLR2通路被激活。Wu Y.等［30］和A.A.I.Arbab等［31］在其研究中也有类似观点。

在革兰氏阳性菌方面，目前研究最多而且比较成功的主要是金黄色葡萄球菌，该菌是引发奶牛乳腺炎最常见的病原微生物之一，目前的大多数研究也以此为出发点进行深入研究。H.Lahouassa等［32］将金黄色葡萄球菌与乳腺上皮细胞共培养，在感染后3，10，24 h测定相关炎性因子的表达。结果发现，与未感染的乳腺上皮细胞相比，感染3 h后的细胞表达了更多的IL-1β、TNF-α、IL-8和GRO-α等炎症因子。崔新洁等［33］用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞，发现能刺激细胞表达IL-1β及TNF-α。赵凌等［34］发现，不同浓度纯化的金黄色葡萄球菌液感染牛乳腺上皮细胞后，细胞因子表达呈上升趋势，其受体表达呈下降趋势，并诱导细胞出现凋亡现象。该试验利用金黄色葡萄球菌进行体外感染试验，为因革兰氏阳性菌感染而导致乳腺炎的致病机制提供了科学依据。

3 中药防治奶牛乳腺炎的研究现状

中药的药理作用众多，兼具抗病毒［35］、抗菌感染［36］。抗肿瘤和提高免疫力［37］等多种药理作用。中药能够减小炎症对机体的损伤，阻碍炎症的发生发展，对炎性介质的分泌具有重要影响。在奶牛疾病临床上，不同剂型的多种中药配方用于治疗奶牛乳腺炎取得了显著的效果［38］。

朱永平［39］利用金银花、紫花地丁、蒲公英等制成中药方剂对患乳腺炎的116头奶牛进行治疗，其中治愈99例，好转12例，有效率达95.7%，且产奶量提高了9.2%。白冬冬等［40］用地肤子、蒲公英等制备的地肤通乳散治疗奶牛乳腺炎，通过临床试验进行疗效观察，结果显示，地肤通乳散对奶牛乳腺炎的治愈率和有效率分别高达63.16%和89.47%。范才良等［41］制备的一种内服中药蒲金散对奶牛乳腺炎的治疗具有良好效果，同时兼具提高产奶量的作用。据报道，利用中药和西药对患乳腺炎奶牛进行对比治疗研究发现，中药治疗总有效率高于抗生素治疗［1］。不同剂型的中药对奶牛乳腺炎的防治也显示出良好的治疗效果，例如透皮剂［42］、软膏剂［43］和灌注剂［44］等。

4 中药干预奶牛乳腺炎细胞模型及其作用靶点研究进展

中药会破坏细菌的细胞壁和细胞膜，还能使细菌的代谢活动紊乱，从而起到杀菌作用。中药具有显著的抗炎作用，对临床型乳腺炎和隐形乳腺炎的防治提供了科学依据。目前的研究表明，中药干预奶牛乳腺炎细胞模型，主要是通过抑制NF-κB信号通路活化，降低下游炎性因子的表达来实现。

Liang D.J.等［45］研究百里香酚对LPS刺激小鼠乳腺上皮细胞的抗炎作用，结果表明，百里香酚能明显抑制LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞中TNF-α和IL-6的生成，iNOS和COX-2的表达也随百里香酚剂量的增多而下降；此外，百里香酚阻断了LPS刺激的mMECs中IκBα、NF-κBp65、ERK、JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化。说明百里香酚通过干扰NF-κB和MAPK信号通路的激活，在LPS刺激的乳腺上皮细胞中发挥抗炎作用。Liu M.J.等［46］验证咖啡酸对LPS诱导的原代牛乳腺上皮细胞炎症反应的抗炎特性，并阐明可能的潜在机制，结果表明，咖啡酸对LPS诱导的bMEC炎症损伤的保护作用是通过减少NF-κB途径中NF-α降解和p65磷酸化介导的促炎性细胞因子的产生而得以实现。Yang W.H.等［47］研究了黄芩苷对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症损伤的保护机制，结果发现，LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症反应，细胞活力下降，p-p65／p65和p-IκBα／IκBα比值上升，TNF-α和IL-1β的表达增加，而用黄芩苷处理后能抑制NF-κB的激活和HSP7上调，减轻LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞的炎症和凋亡。Wang J.J.等［48］研究了桑色素对脂多糖刺激原代牛乳腺上皮细胞的抗炎作用，结果发现，桑色素以剂量依赖性的方式抑制LPS刺激的牛乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表达，得出桑色素对LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应的保护作用可能与其抑制NF-κB／MAPK信号通路有关。S.Kang等［49］为确定植物皂苷是否能减轻LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症反应程度，先用植物皂苷预处理细胞，然后再用LPS处理，结果发现减弱了LPS诱导的NF-κB活化和超氧物的产生，下调了环氧合酶2（COX-2）的表达。

除此之外，Miao J.F.等［50］探讨了牛磺酸对脂多糖（LPS）诱导的小鼠乳腺上皮细胞功能损害的保护和抗炎作用，他们发现牛磺酸可明显抑制LPS诱导的NAGase活性、NO浓度升高及TNF-α、IL-1β、IL-6和LF水平的升高，45 mmol／L牛磺酸显著增加了LPS诱导的功能失调的β-酪蛋白分泌。结果表明，牛磺酸可显著抑制LPS诱导的炎症因子释放，增加乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白，为牛磺酸对LPS诱导的乳腺上皮细胞功能障碍的保护作用提供了可能的解释。

目前国内外对中药作用LPS诱导的乳腺上皮细胞模型的研究较为广泛，但是对于中药作用LTA诱导的细胞模型相关报道还较为稀缺。孙静等［51］用40μg／mL LTA处理乳腺上皮细胞24 h后建立了炎症损伤模型，并从10味中药中筛选到5种对奶牛乳腺炎致病菌具有较好抑制作用的中药，组成配方作用于炎性细胞。结果发现该组方对炎性损伤具有一定保护作用，对促炎性因子基因的表达产生抑制作用。此外，还有一些研究直接针对由金黄色葡萄球菌刺激牛乳腺上皮细胞引起的细胞炎症。Wang K.等［52］的研究表明，中国蜂胶可以防止由金黄色葡萄球菌引起的牛乳腺上皮细胞活力受损，下调细胞炎症因子（IL-1β、TNF-α）的表达。Zhang J.L.等［53］发现，连翘苷A可以干扰由金黄色葡萄球菌引起的NF-κB和MAPKs信号通路的激活，在金黄色葡萄球菌刺激的牛乳腺上皮细胞中具有抗炎作用。

5 前景及展望

由于奶牛乳腺的特殊生理结构，易受病原微生物的入侵而发生炎症，细菌侵入乳腺上皮细胞是建立乳腺内感染的重要一步［22］。随着抗生素耐药性逐年增加，以及抗生素难以进入细胞体内，导致其对病原菌导致的奶牛乳房炎治疗效果降低，使得乳腺炎反复发作，难以根治［54］。中草药含有多种生物有效成分，对奶牛疾病预防和治疗效果良好，不良反应小，几乎无残留、无抗药性、对乳制品无副作用，作为奶牛乳腺炎的治疗药物克服了抗生素的某些不足，在防治奶牛乳腺炎方面具有独特的优势。目前，通过中药治疗主要通过TLR2／4与NF-κB信号通路降低炎性因子的表达。NF-κB是真核细胞转录因子Rel家族成员之一，是信号传导通路的聚集点，在调节炎症和对外来刺激免疫应答方面起着重要作用，NF-κB被激活后进入细胞核内与靶基因上的特定位点结合，发挥转录调控作用，从而导致大量具有致热活性炎性因子的合成和释放，主要有TNF-α、IL-1β、IL-6等。中药对乳腺上皮细胞作用抑制TLR2／4与NF-κB通路的激活，从而抑制炎症因子的表达，由此增加细胞活力，抵御病原微生物对奶牛乳腺的侵袭，达到防治奶牛乳腺炎的目的。目前的研究主要集中于单种中药成分对乳腺上皮细胞的作用，对中药组方的研究还比较罕见，对未来利用中药组方防治奶牛乳腺炎、相互配伍取得更好疗效值得期待。