高危非肌层浸润性膀胱癌分子分型的价值与研究现状

蒋 凡，贺大林，吴开杰

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

膀胱癌(bladder cancer,BCa)是泌尿系统中仅次于前列腺癌之后第2位的常见肿瘤，在各种肿瘤中，其发病率居第11名。全世界范围内，男性膀胱癌年龄标准化发病率为9.0/(10万人·年)，女性为2.2/(10万人·年)[1-2]。初诊的膀胱癌中，75%为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，包括Ta、CIS、T1期。对于NMIBC患者，通常选择经尿道膀胱肿瘤切除术+术后辅助灌注治疗[3]，然而50%～70%的患者会复发，10%～15%的患者会进展为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。

在NMIBC中，T1HG或T1G3膀胱癌是最复杂的一种，其临床特征、生物学和组织学特征是可变且不可预测的，目前尚无明确的标准来判断和区分这种高危NMIBC复发和进展的风险，对泌尿外科医生和患者来说都是一个巨大的挑战。因此，确定可以对这些患者进行危险度分层并指导后续治疗抉择的方法十分重要。伴随着生物检测技术的快速发展，通过基因测序或分子标记物检测对T1HG膀胱癌进行分子分型有望解决这一难题[4]，更好地指导临床选择早期根治性膀胱全切抑或保留膀胱的治疗策略。

遗憾的是，膀胱癌分子分型相关的研究大多是基于MIBC完成的，关于NMIBC的基因检测和分子分型的研究工作相对较少，也没有形成统一的共识，本文将梳理高危NMIBC基因检测或分子分型的最新研究进展以及其潜在的临床价值，以期为高危NMIBC的临床治疗决策提供帮助。

1 膀胱癌分子分型研究现状

目前有关膀胱癌分子分型的研究主要集中在MIBC，已报道的研究包括贝勒大学(Baylor)、北卡罗来纳大学(the universityof north carolinaat，UNC)、德克萨斯大学安德森癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center，MDA)、肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、Cartes d’Identité des Tumeurs Curie(CIT-Curie)和瑞典隆德大学(Lund6)6种，均基于基因测序和聚类分析的方法建立。为了便于临床普遍开展，也有学者认为可以利用CK5/6、CK20、CD44及GATA3等常见分子标记物的免疫组化染色来简单区分，分为管腔型(luminal)和基底型(basal)。对于NMIBC分子分型研究相对较少，为大家熟知的有UROMOL分型。

1.1 MIBC分子分型的共识尽管MIBC的分子分型已经比较完善，但上述6种方法仍有不同，为了方便使用，国际上综合上述方法，达成共识，将MIBC分为6种[5]，分别为luminal papillary型(LumP型)、luminal Non-specified型(LumNS型)、Luminal Unstable型(LumU型)、stroma-rich型、Basal/Squamous型(Ba/Sq型)和Neuroendocrine-like型(NE-like型)。在基因组改变上，LumP型主要富含FGFR3突变、KDM6A突变以及CDKN2A的缺失；LumNS型的主要特征是ELF3突变和PPAGR改变；LumU型肿瘤主要是发生PPAGR的突变、包含E2F3和SOX4的6p22.3区域的高水平扩增、ERBB2突变、TP53突变，它是基因组改变最显著的一类；对于Ba/Sq型肿瘤，其主要改变是TP53和RB1突变，部分也存在3p14.2的缺失；在NE-like型中，同时存在TP53和RB1的失活；stroma-rich型的基因变化不明显。

1.2 MIBC分子分型的特征研究表明，MIBC的分子分型与临床特征密切关联[5]，Ba/Sq型在女性和T3/T4分期中的比例较高，LumP型和LumU型在T2期中较多，LumP型在年龄偏小(<60岁)的患者中较多，而LumNS型在年龄偏大(>60岁)的患者中较多。同时，MIBC的基因分型有助于医生判断患者的临床预后，在这6种类型中，LumP型的预后最好，LumU型和Ba/Sq型的预后相对不好，NE-like型的预后最差。

1.3 MIBC分子分型的价值MIBC的分子分型在治疗方面有重要的指导作用，可以帮助预测化疗、免疫检查点抑制剂及其他新型药物的疗效。LumP型肿瘤中纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)的突变率和易位率高，提示LumP型肿瘤可能对FGFR3抑制剂有反应[6]。Ba/Sq型表达高水平的表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)及配体，提示其可能对EGFR的靶向疗法敏感。同时，Ba/Sq型高表达免疫检查点标记和抗原呈递相关基因，提示其对免疫疗法可能有较高的敏感性。NE型和LumU型肿瘤对放射疗法具有潜在的反应，表现为细胞周期活性增强和低氧信号。在新辅助治疗方面，Ba/Sq型和LumNS型肿瘤患者可能受益，stroma-rich型则不会受益。基于以上特征，可以帮助医生为患者选择更合适的治疗方式。

2 高危NMIBC分子分型的研究状况

目前认为，NMIBC和MIBC之间的癌基因存在差异扩增和上调，同时在抑癌基因中也存在不同的突变和染色质修饰行为[7]。在癌基因方面，FGFR3在NMIBC中更常见，通常会有较好的预后。E2F3通常在MIBC中表达增加或者上调，如果在NMIBC中出现，则预示进展的风险增高。低级别肿瘤中的STAG2突变率较高，染色质修饰基因突变率较高，例如KDM6A突变率为24%，PTEN杂合子和纯合子突变分别为22%～55%和4%～6%，KMT2D失活突变为77%，这为风险评估提供了新的手段[7]。鉴于它们的差异，我们有必要对NIMBC进行相应的分子分型。

2.1 NIMBC分子分型的方法

2.1.1基因(12种)分类 DYRSKJOT等[8]的一项研究发现周围有原位癌(carcinoma in situ，CIS)和没有CIS的移行细胞癌的基因表达有很大的区别，周围有CIS的NMIBC与MIBC之间存在相似的基因表达，但没有发现CIS与浸润性癌有密切关系。基于此，他们建立一个包含16个基因的CIS分类器，能够根据周围CIS的存在与否对NMIBC进行分类。在这项研究中，CIS基因特征不仅在CIS中存在，在NMIBC、MIBC及正常膀胱尿路上皮中也存在，CIS的存在与疾病进展的风险相关。之后该团队在原有研究的基础上进一步优化，确定将以下12个基因作为判断预后的标记，与非进展性肿瘤相比，进展性肿瘤有7种基因表达上调(KPNA2、BIRC5、UBE2C、CDC25B、COL4A1、MSN和COL18A1),有5种下调(COL4A3BP、MBNL2、NEK1、FABP4和SKAP2)，从而鉴别出进展风险更高的肿瘤[9]。他们的这项研究是基于临床终末结果来寻求生物标记物，对于NMIBC的分型具有重要意义。

2.1.2UROMOL研究 UROMOL研究是一项寻找NMIBC进展预测因子的大型研究[10]，由欧洲7家机构合作进行。该项研究纳入460例NMIBC患者，通过全面的转录水平分析及共聚类分析，确定了一个基于117个基因的分类器，将NMIBC分为3类。在临床特征方面，第2类和第3类中高级别、高分期、合并CIS以及进展为MIBC的肿瘤更常见。在分子特征方面，第1类和第2类均表现出luminal型特征，均高度表达尿路蛋白和分化相关标记物。第1类肿瘤预后较好，细胞周期早期基因高表达。第2类肿瘤预后较差，细胞周期晚期基因高度表达，与CIS病变相关的KRT20、标记肿瘤干细胞的ALDH1A1、ALDH1A2、NES、THY，以及与上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关的转录因子高度表达。第3类表现出basal型的特征，标记未分化细胞(即基底细胞)的KRT5/15和CD44表达增高，其基因改变以抑制为主，具有较低的细胞周期和代谢活性，提示其可能处于休眠状态。在第2类和第3类肿瘤中，KRT14的表达均增加，KRT14通常在KRT15表达之前的未分化细胞中高表达，提示第3类可能会转变为第2类。除此之外，第2类具有重要的肿瘤驱动基因突变(TP53和ERBB2)和APOBEC相关突变特征，与DYRSKJOT等确定的进展高风险肿瘤类型具有相似的基因改变，提示其可能通过CIS通路进展。第1类和第3类具有FGFR3突变特征，提示其可能通过Ta通路进展。此项研究第一次在NMIBC中发现基底型特征，加深了对于NMIBC的认识，进而优化患者的治疗与管理。

2.1.3基因(5种)分类 HEIJDEN等[11]的研究第一次聚焦T1HG高危NMIBC的分子分型。他们对无CIS的进展性和非进展性T1HG膀胱癌的差异基因表达水平进行了研究，最终确定了1组预测进展风险的5项基因标志(ANXA10、DAB2、HYAL2、SPOCD1和MAP4K1)，这5个基因之间并没有直接的相互作用，在不同的途径起作用。在之前的研究中，ANXA10、DAB2、HYAL2、MAP4K1已被证实与膀胱癌相关，SPOCD1的变化是第1次被报道与膀胱癌相关联。相较于之前的研究，该项研究的优势在于使用qPCR的方法，操作简单，成本较低，便于在临床中开展。

2.1.4基因(8种)分类 KANG等[12]对103例NMIBC患者的标本进行了全基因组表达分析，鉴定出与T1HG膀胱癌患者病情进展相关的8个基因(S100A8、PFKFB4、HMOX1、KIF1A、COCH和CELSR3升高，MGC17624和MTAP下降)，并基于此制作了分子进展风险评分表(MoPRS)来预测NMIBC的预后。该评分表在1个75例T1HG膀胱癌患者队列中得到验证，证明MoPRS是判断T1HG膀胱癌患者病情进展的独立预测因子。

2.1.5基因(57种)分类 WANG等[13]开发了1种基于57种基因、利用qPCR预测NMIBC进展风险的方法。他们通过比较已发表的膀胱癌微阵列数据集，确定了96个与侵袭性相关的基因，进而对96例膀胱肿瘤组织进行mRNA表达分析，最终筛选出57个基因(37个基因表达升高、20个基因表达降低)预测NMIBC(Ta和T1期)进展为MIBC的风险。上调基因主要以细胞粘附、细胞外机制入侵途径、细胞周期调节和有丝分裂相关基因为主；低表达基因与低分化肺癌、浸润性乳腺癌中的低表达基因重叠，同时p53、RB1等已知的抑癌基因也在下调基因之中。在该研究中，ACTN1和CDC25B首次在膀胱癌中被提到。免疫组化证实在膀胱癌中ACTN1以胞质表达为主，CDC25B以核表达为主。ACTN1在非侵袭性组和侵袭性组之间差异最明显，CDC25B的表达随疾病严重程度呈线性增加趋势，这提示可以利用免疫组化的方法进行分类。该项研究汇集了之前的研究中最基本的基因，并促进了相关基因复杂相互作用的进一步研究。

2.1.6结合病理分期分级的基因分型 DESCOTES等[14]利用基因芯片对108例膀胱肿瘤进行分析，将T1期肿瘤分为病理T1a期和T1b期。首先根据肿瘤分期分级确定了322个探针的差异，相关基因主要与细胞周期基因高表达、免疫信号基因高表达和异源性代谢低表达相关。另外，进行组织学层次分类，验证分子特征可以区分低级别(Ta低级别)和高级别肿瘤(T1b、T1a、Ta高级别)，高级别组主要与细胞周期基因高表达、免疫信号基因高表达、细胞发育相关基因高表达和异源性代谢低表达相关。利用qPCR在另一个膀胱肿瘤队列中得到验证，并确定了38个表达差异的基因。T1b期肿瘤的侵袭性比T1a期肿瘤强，更接近于MIBC，病理T1a期和T1b期二者之间存在明显的基因标记差别。

2.1.7下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术的应用 以上所有这些研究都是基于微阵列技术进行的，现在转录组学领域已经被RNA测序所取代。最近的一项研究对23例高风险NMIBC患者进行了NGS，比较了膀胱内治疗有反应的肿瘤和进展为MIBC的肿瘤基因组图谱，寻找与高危NMIBC进展相关的新遗传特征[15]。发现进展患者和非进展患者的DNA突变谱(TP53、PIK3CA、KMT2D、TERT的突变率)没有差异，而CDKN2A和CDKN2B的突变和拷贝数变化可能是预测进展的生物标志物，这表明P53的缺失可能为膀胱癌进展的早期事件，而CDKN2A和CDKN2B的丢失可能是发生膀胱癌进展的一个重要步骤，这也支持了p16/P53/RB1信号参与高危NMIBC进展的观点。

2.2 NIMBC分子分型的价值MIBC的治疗主要关注患者生存期和对辅助治疗的敏感性，NMIBC治疗的关键在于判断肿瘤复发和进展风险，从而选择早期膀胱全切抑或膀胱灌注治疗策略[3]。特别是对于T1G3膀胱癌，除了关注临床病理因素，如肿瘤大小、多灶性、复发间隔、是否合并CIS、有无淋巴血管侵犯以及临床亚分期[3]，还应确定其分子分型，从而判断哪些患者发生进展的几率更大。上述研究中的分子分型办法给我们提供了参考，便于我们来选择行早期胱切除术或避免膀胱切除，以减少手术并发症发生及对生活质量的负面影响。

3 NMIBC分子分型的前景

虽然NMIBC分子分型的相关研究还比较少，但随着测序技术不断提升和成本降低，关于NMIBC分子分型的研究将越来越多，有助于加深在基因和分子层面对NMIBC的认识，从而更好地指导泌尿外科医生治疗患者，减少高风险患者肿瘤进展和致死的风险，低风险患者免去切除膀胱的痛苦。