哺乳动物肠道抗菌蛋白的研究进展

宋云云，陈韬

（湖南农业大学，湖南长沙410128）

哺乳动物胃肠道不仅是体内最大的食物消化吸收代谢器官，也是体内最大的消化免疫代谢器官[1]。肠道内的组织中经常可能会因为受到多种病原微生物感染引起多种疾病，如急性腹泻、肠道黏膜炎症等多种疾病，使肠道黏膜屏障功能持续受到严重的破坏。为了有效应对这些严重挑战，肠道黏膜下的上皮细胞表面还会产生大量的活性抗菌蛋白（Antimicrobial proteins，AMPs）。能杀死肠道中的大部分致病菌，是构成机体天然自身免疫系统的重要成分，在机体抗肠道感染和治疗炎症中发挥重要作用[2]。与其他传统外用抗生素相比，大多数AMPs 具有抗菌谱广、抗菌活性高、热力学稳定性强、不易产生耐药性等诸多优点。此外一些AMPs 还具有促进细胞增殖、损伤修复、免疫功能调节等多种重要功能，是一种目前具有巨大开发应用潜力的新一代抗生素的替代品。所以，本文对哺乳动物中的AMPs种类、功能和表达以及调控反应机制等多个方面相关研究成果进行系统整理分析归纳，为有关AMPs部分替代抗生素在畜牧动物养殖生产方面的广泛应用研究提供重要参考。

1 哺乳动物肠道AMPs 的种类

AMPs 是宿主肠道通过免疫防御反应系统产生的能对抗外源性病原体的一种防御性生物肽类活性化学物质，又叫作抗微生物肽或抗生素肽。哺乳动物肠道中起主要作用的AMPs 主要种类有以下几种：

1.1 防御素

防御素（defensin）是一类富含多个半胱氨酸的阳离子活性肽，分子量约为 3～4 kDa，由 29～38 个氨基酸组成。目前已经发现防御素存在于人体内和各种哺乳动物中最多，其中一些防御素还具有广谱性的抗菌活性[3,4]。根据各种氨基酸分子序列和分子形态结构的相互差异性，可将防御素分为α- 防御素、β- 防御素和θ- 防御素。α- 防御素是最早被发现的AMPs 家族之一，在哺乳动物中主要存在于小肠Paneth 细胞分泌颗粒中和肠腺的隐窝腔内[5]。在人类Paneth 细胞中只表达HD5 和HD6 两种α-防御素[6]；在小鼠Paneth 细胞中表达了比较多的为一个隐窝受体蛋白（cryptdins）和一个CRS 相关因子序列; 而在猪的肠道内目前还没有发现任何α-防御素。β- 防御素主要在哺乳动物小肠的上皮细胞表达，同时它在小肠Paneth 细胞和中性粒细胞均具有明显表达，当受到某种外源致病微生物直接入侵时可启动表达防御机制。α- 防御素和β- 防御素均具有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒以及原虫的活性[7,8]。θ- 防御素的发现较晚，仅存在于恒河猴的中性粒细胞和单核性粒细胞的颗粒中,只在骨髓中表达，人和其他哺乳亚类动物体内目前尚未完全发现θ- 防御素的具体表达[9]。

1.2 C 型凝集素

人体内Paneth 细胞主要负责分泌RegIIIα，小鼠分泌为RegIIIγ。RegIIIγ 是AMPs 中最重要的一种新型AMPs，是一种分泌型小分子，但同时缺乏其他C 型凝集素中的补体招募区域，能直接结合肽聚糖杀灭革兰氏阳性菌，主要在哺乳动物的肠道和皮肤当中表达，具有抗菌、抗炎、损伤修复和促进上皮细胞良性增殖等多种作用功能[10,11]。在猪的肠道中，RegIIIγ 主要由位于肠道的吸收性上皮细胞和肠道Paneth 细胞结合产生。其可通过调节肠道微生物和肠道宿主之间的空间免疫分布，以及肠道宿主黏膜的共生免疫作用应答，有效维持肠道微生物与肠道宿主之间的一种共生免疫关系[12,13]。但是，RegIIIγ 在研究猪肠道或其他组织系统中的各种相关免疫功能及其表达调控作用方面仍然一直存在着很多空白。RegIIIγ 的表达需要活化TLR-MyD88 途径，而激活了MyD88 下游哪些信号分子目前尚不明确。

1.3 溶菌酶

溶菌酶是一种具有高酶活性带正电荷的AMPs，可以在不损害机体的情况下，有效杀伤各种病原体。目前，人类最了解的溶菌酶是C 型溶菌酶，它包含一条肽链，129 个氨基酸，分子量约为14.3 kDa，内部分别存在4 个二硫键，具有大量的α 双螺旋分子结构，因此热力学稳定性和耐高压性比较强。溶菌酶C 不仅在Paneth 细胞中可以表达，还可以存在巨噬细胞和某些中性粒细胞颗粒中。尽管它的活性较低，但在某些免疫部位会出现高浓度溶菌酶表达，表明这种溶菌酶在哺乳动物先天性免疫系统中起着重要的作用。研究人员发现，在人类和小鼠中均存在多种溶菌酶，其中人类仅存在一种溶菌酶 C，而小鼠中存在两种：P 型（由 Lyz1 编码）、M型（由Lyz2 编码）。有研究对小鼠敲除Lyz2 的数据分析结果显示，溶菌酶C 阻止肽聚糖在组织中的积累，以避免由于细菌细胞壁抗原体的持续存在而导致的延长促炎性反应，经过肠组织中清除肽聚糖对P 型溶菌酶是否起作用还未被研究[14]。

1.4 Cathelicidins

Cathelicidins 是一类含有保守Cathelin 区域的AMPs，在多种哺乳动物的肠道均有表达，在结构上存在很大差异，该基因可编码一个前体蛋白（cathelicidin antimicrobial protein，CAMP），通过不同的剪切方式产生几个均具有抗菌活性的蛋白[15]。如Cathelicidin 基因存在于人类中是HCAP-18，已经被证明产生至少三种不同的成熟抗菌肽，其中LL-37 研究最多[16]。按照二级结构可大体分为以下四大类：α- 螺旋cathelicidins、延伸- 螺旋cathelicidins、环状 cathelicidins 和 β- 片层 cathelicidins。

1.5 磷脂酶 A2（PLA2）

PLA2 是一类体内分布广泛并能够参与体内磷脂蛋白代谢的水解酶，主要广泛存在于哺乳动物的上皮组织细胞和分泌物中。在正常人体中，几乎所有细胞均含有PLA2，但它主要广泛分布于胃肠道、皮肤、心血管等重要部位[17]。研究人员发现，肠内分泌型磷脂酶A2(简称为PLA2G2A)基因是小鼠系中自发形成肠腺瘤和肿瘤的一种修饰重要基因，但导致小鼠肿瘤程度增加的机制是否间接涉及到影响小鼠肠道内磷脂酶的抗菌活性还没有证据确定[18]。

1.6 核糖核酸酶

血管生成素4(ANG4)是近年来发现的一种新型AMPs，是一种强分泌性单链血管蛋白，属于核糖核酸酶超家族中的成员，其分子具有较低的核糖核酸酶活性，主要在哺乳动物的肠道中进行表达。而且它还具有抗菌活性和促进血管生成等多种生物学功能。研究人员在观察仔猪肠道ANG4 的表达特点时，发现其肠道表达量会随着每头仔猪周龄的快速生长而不断升高，其表达部位主要在位于肠道的上皮绒毛细胞和潘氏细胞，其中又以小肠上皮绒毛顶端表达量最为突出，而小肠隐窝处也可能有少量表达[19]。

2 AMPs 的生物学功能

2.1 抵抗病原微生物

天然自体免疫系统通过分泌表达一种称为AMPs 的阳离子肽类抗生素，有效地防止致病微生物直接感染受到严重破坏的体表面。Ouellette 等人[20]研究发现在对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和其他防御素敏感的鼠伤寒沙门氏菌phoP-/- 突变体的抗微生物活性测定中可以发现，无论是从皮肤组织还是毛细管腔中将其分离，Cryptdins 均具有相同的体外抗菌活性。相反，N 末端截短 Cryptdin-6 和Cryptdin-4 的活性均有明显降低，这些都表明N 末端Gly 残基或Cryptdin-4 N 末端的长度是杀伤微生物的主要决定性因素，在隐腔内的一种先天免疫可通过肽分泌后对α- 防御素的氨肽酶进行修饰作用来进行调节。Cash 等人 [21]研究结果发现，RegIIIγ 作为一种可以直接杀菌的活性C 型凝集素，在抗菌联合作用中具有一定的抗菌选择性。它容易与革兰氏阳性菌的细胞膜直接结合，可特异性杀伤革兰氏阳性菌。Ebbensgaard 等人[22]证明了在Cathelidicin 家族成员中有两个家族成员Cap18 和Cap11 具有强大的抗菌活性，特别是针对革兰氏阴性菌病原微生物，包括鱼类和家禽生产中发现的病原微生物。

2.2 抗炎作用

AMPs 可以直接充当中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T 细胞的趋化因子或刺激宿主中性粒细胞和单核肥大细胞趋化因子的快速释放，使它们能够快速聚集在炎症趋化反应多的部位，发挥各自部位相应的趋化功能并有效降低其他炎症趋化反应，如起源于哺乳动物的α-defensins、β-defensins 和LL-37 等。Wehkamp J 等人[23]研究发现，Paneth 细胞α- 防御素分泌的减少，被证明是导致克罗恩回肠炎先天性免疫功能紊乱的关键因素。

2.3 调节肠道菌群

Paneth 细胞分泌中的AMPs 通过调节肠道中的微生物和生态系统的组成，有效地调节固有角质层中T 细胞反应，从而有效改变促黏膜炎症反应和调节反应之间的平衡。Salzman 等人[24]在使用防御素缺乏症（MMP7-/-）和盈余（HD5+/+）的互补小鼠模型发现，小肠优势菌种中防御素依赖的相互转换而总细菌数没有变化。此外，HD5 表达的小鼠显示出明显的节段丝状细菌（SFB）丢失，从而导致固有层中Th17 细胞数量减少。该研究报道进一步证明了Paneth 细胞Defensins 通过调节小肠微生物群在肠道内稳态中的新作用。

2.4 免疫调节

AMPs 除了通过自体免疫机制杀灭各种病原体防止各种病原体和微生物进入免疫宿主体内，还可通过分泌多种位于自体免疫细胞内的免疫细胞因子有效抑制致病机体的炎症代谢反应，并通过自体免疫调节系统发挥作用，调节细胞内促炎信号的激活来发挥抗炎作用，如抗菌肽LTP-20 可通过作用NF-κB 通路和MAPK 信号通路降低LPS 刺激产生的促炎因子水平[25]。同时，Steenwinckel 等人[26]发现IL-9 出现过表达后，小鼠肠黏膜肥大细胞数量增加，表明了该细胞因子可能在肠道炎症反应中发挥着重要的作用。当IL-9 上调杯状细胞相关基因（如Muc2、CLCA3）的表达时，还通过上调Paneth 细胞分泌物的表达 (如 ANG4、Criptdins 和 PLA2g2a)这一活性的表达需要IL-13 介导。

2.5 损伤修复和促进细胞增殖

AMPs 中比较典型的有：RegIIIγ 蛋白是能够通过作用促进胰岛细胞的复制和正常再生，使胰岛细胞体积不断增大和能够抑制细胞正常凋亡，从而能够促使胰岛细胞正常生长和对抗损伤进行修复。易宏波等人[27]用Caco-2 细胞黏膜刮损损伤修复模型研究发现，AMPs CWA 可以显著提高刮伤上皮细胞的黏膜愈合修复速度，改善对受损的肠道上皮刮伤细胞的愈合修复损伤功能。Christa 等人[28]发现HIP/PAP 蛋白在肝癌细胞中有特异的活性化学表达，并与鼠体内肝肿瘤细胞和肝癌细胞外膜的基质相互作用。这些研究结果表明，抑制HIP/PAP 蛋白极有可能对大鼠肝癌细胞的基质分化/细胞增殖过程具有潜在的化学重要性。

2.6 其他作用

如ANG 家族有促进血管生成作用、新型AMPsDP7 能抑制细胞凋亡。

3 AMPs 的作用机制

研究发现，AMPs 的抗菌机制按其主要靶点部位可以划分为细胞壁破坏机制、破膜机制和胞内破坏机制。细菌细胞壁的主要成分之一是肽聚糖，对维持细菌的细胞正常形态至关重要，一旦细胞壁被溶解，其壁膜通透性大大增加，就会造成部分细菌渗透压严重失衡，细胞壁膜破裂，内容物基质流失排出，细胞迅速死亡。乔媛媛等人[29]通过镜下观察到在AMPs 经过处理后的正常生长大肠杆菌的细胞形态发生变化，并在其作用12h 后质壁完全分离，细胞壁内部出现微小空泡且细胞界限模糊，细胞具有走向正常死亡期的趋势，说明AMPs 可能会破坏细胞壁引起细胞死亡。Mukherjee S 等人[30]随后报道了肠道细菌组织中仍然存在大多数AMPs 以细菌的细胞壁结构为靶点，通过攻击细菌的细胞壁结构来介导杀伤细菌。上皮组织细胞中经常存在许多AMPs 也都是通过非酶细胞壁直接刺激机制而杀伤细菌，如RegIII 家族的C 型凝集素、防御素和组织蛋白酶。此外，还有某些肠上皮AMPs 通过利用干扰抑制细菌细胞壁合成来调节抗菌作用，例如：人β- 防御素3 和肽聚糖前体脂质II 的结合，从而通过干扰细胞壁生物合成导致局部细胞壁黏膜损伤，造成细菌在低盐条件下渗透性破裂死亡[31]。

目前已经发现的细胞膜孔道形成机制主要类型有“地毯样”、“环形”、“桶形”以及“聚集通道”模型。其中细胞膜是AMPs 的主要靶点。大多数AMPs具有阳离子特性，正电荷残基与细胞膜上的负电荷发生静电相互吸收作用，然后将其插入细菌的细胞膜外壁，其疏水残基构成二级结构，亲水部分与胞膜脂质相结合，形成管壁通道和跨膜离子通道，从而破坏了细菌的膜完整性，导致了细胞中的大量物质外流，导致细胞死亡。Ito T 等人[32]在研究防御素家族成员中人BD3 抗菌的机制时，发现AMPs 主要结合于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜表面的糖链，MRSA 聚集在细胞膜的表面，然后经过一系列反应，结合表面正负电荷，导致MRSA 细胞膜破裂的内容物从细菌中流出死亡。Yang D 等人[33]发现cathelicidin 家族成员中的LL-37，不仅能够直接杀死MRSA，而且能够抑制球菌细胞膜的形成和破坏已经形成的球菌膜。有研究显示，AMPs 中PR-39 和Lfcin 等基因可以与胞内靶点相结合，抑制细菌DNA表达，最终致死细菌[34]。单安山等人[35]的研究发现，猪小肠中性粒细胞的一种AMPs(PR-39)含有丰富的脯氨酸和精氨酸，能够在细菌内发挥作用，抑制NADPH 氧化酶复合物的组装，导致不能产生活性氧，细菌内的代谢不能进行，从而阻碍细菌的生长繁殖。AMPs 还可以直接地影响菌群内功能蛋白的构象或结合细胞膜，使胞内功能蛋白丧失活性[36]。AMPs 的作用机制首先作用于细胞膜，使通透性增加进入细胞膜中，再作用于胞内蛋白质、核酸等物质，从而抑制细胞壁合成和胞内蛋白质的表达，在细菌体内形成一种相互协同的作用机制，最终达到抑菌的作用。

4 AMPs 表达的调控

有些AMPs 具有双向作用，当其表达不当是，极易引起不必要的炎症反应，因此其表达和分泌受到诸多方面严格的表达调控，其中包括转录调节、发育调节、分泌调节以及翻译后修饰。

4.1 转录调节

在肠道组织中，大多数AMPs 的表达是诱导型的。无菌饲养的小鼠在肠道组织中检测不到RegIIIγ 和ANG4 蛋白的表达，但在常规饲养条件下表达明显升高，说明了RegIIIγ 和ANG4 蛋白的表达受到某种微生物信号的调节[37]。此外，RegIIIγ 的表达受到天然淋巴样细胞（ILCs）产生的白细胞介素22（IL-22）的诱导;ANG4 的表达则受到 IL-25 的诱导，并IL-13 呈现剂量依赖性[38,39]。同时，也有少部分AMPs 的表达是组成型的。其中许多AMPs 的表达不依赖于微生物菌群，如肠道中大部分α- 防御素的表达，则需要WNT 信号通路途径的转录因子TCF4，但不受到微生物菌群的影响[40,41]。同样，溶菌酶、磷脂酶A2 和部分β 防御素的表达也不需要细菌信号[42,43]。

4.2 发育调节

动物发育过程的转变也是影响某些AMPs 表达的因素。ANG4 和RegIIIγ 在小鼠新生早期表达明显升高，与断奶前后相比，ANG4 的表达水平可升高20 倍左右，而RegIIIγ 的水平则可达到约3000 倍，这种变化的原因很可能是作为对断奶后引起的免疫撤除的应答，产生相应的AMPs 来进行补偿[37]；相反，Cathelicidin 的表达则在断奶前开始下降，成年以后几乎消失[44]。

4.3 分泌调节

在哺乳动物肠道中，Paneth 细胞产生大量的AMPs，包括α 防御素、溶菌酶、磷脂酶A 2 和ANG4 等。这些AMPs 的分泌是在Paneth 细胞暴露在细菌或细菌表面分子后的反应，如脂多糖，这也意味着AMPs 的分泌是作为遇到细菌潜在威胁的应答而精确控制的[45]。

4.4 翻译后修饰

由于部分AMPs 是通过破坏细菌细胞膜来杀灭细菌的。因此，该AMPs 对宿主细胞具有潜在的毒性，其杀菌活性在合成后细胞内储存过程是受到严格控制。而小鼠α- 防御素是以没有活性的前体进行储存在分泌颗粒中，通过MMP7 的作用产生成熟的具有活性的形式α- 防御素[46]；而人α- 防御素的激活则需要依赖于胰蛋白酶[47]。同样，RegIIIγ和Cathelicidin 也是以没有活性的前体形式储存在分泌颗粒中，分别在胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的作用下转变成成熟的AMPs[48,49]。

5 AMPs 的表达调控机制

AMPs 的表达由多种信号通路精确的调控，如Toll 受体 （TLR） 信号通路、MyD88 信号通路中NF-κB、MAPK 信号通路以及组蛋白去乙酰化修饰途径等。而TLR 受体是模式识别受体（PRR）家族，是第一个被发现的PRR，病原体相关分子模式（PAMP）最为常见，代表性最强的是革兰阳性菌的PG 和革兰阴性菌的LPS，它们可结合Toll 受体向宿主发出感染信号，并触发炎症[50]。越来越多的研究表明，肠上皮细胞水平的TLR 信号转导途径是保护肠道免受致病菌侵袭的关键。研究发现，夜蛾的免疫途径中存在两种信号转导因子，其中MyD88和Pelle 两种信号途径的RNA 干扰能够显著抑制磷脂酶A2 的活性，而当受细菌入侵时能够通过Toll 受体信号通路诱导磷脂酶A2 的表达[51]。Dou X J 等人[52]发现 TLR2/4 可通过 p65 磷酸化和 NF-κB抑制蛋白激酶的延迟合成激活NF-κB 途径，从而促进AMPs 的表达。组蛋白修饰是一种精确调节抗菌蛋白的重要途径，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是组蛋白修饰中的一种重要的方法。Fischer N 等人[53]的研究表明，HDAC 抑制剂通过调节组蛋白修饰，显著提高肠道上皮AMPs 表达，但不影响促炎因子表达。Schulthess J 等人[54]研究表明，丁酸通过抑制HDAC3 提高启动子区域组蛋白乙酰化组蛋白H3第9 赖氨酸（acH3K27） 水平，能够促进 AMPs(S100A8/A9/A12)表达，提升小鼠巨噬细胞清除细菌的能力。肖熠[55]在探究宿主- 肠道微生物中的作用和机制时，发现IL-33 可独立诱导RegⅢγ 在肠上皮的表达，然后通过mTOR、MEK-ERK、STAT3 三条信号通路调节肠上皮细胞分泌达的RegⅢγ 蛋白。在肠道组织中AMPs 的表达受到多种信号分子的共同调控，受到不同刺激源对AMPs 的表达调控机制存在差异，对机体产生了不同影响。

6 总结与展望

随着抗生素耐药性的威胁越来越大，一种新的绿色健康的“抗生素”显得尤为重要。在众多抗生素的替代品中，肠道AMPs 部分替代抗生素成为了重要研究对象，作为小分子疗法替代品有着广阔的前景。在畜牧养殖中，AMPs 作为一种饲料添加剂，能改善动物肠道微生物菌群的结构，抑制病原微生物的繁殖，提高动物的生产性能；在食品行业中，AMPs 可以用作食品防腐剂和增效剂，为功能性食品开发提供新的途径。因此，本文就肠道AMPs 的种类、特性、生物学作用以及表达调控机制进行了归纳。但是要将AMPs 真正地应用到临床治疗与生产实践中，还存在许多需要解决的问题:（1）AMPs表达含量少，增加了提取难度，无法满足市场应用的需求量，人工合成AMPs 成本比较高。（2）AMPs结构简单，大多数呈短肽链，其稳定性较差。（3）AMPs 具有双向作用，存在一定的安全性，在安全性方面有待考察。目前，AMPs 还处在研究阶段，其分子机理、药物代谢规律尚未完全明确，但抗菌谱广，具有不易产生耐药性的优势，且不同的AMPs 具有各自的生物学特性。所以综上所述，只要经过不断深入的研究和了解，AMPs 将成为未来部分替代抗生素的物质，从而减少抗生素的滥用以及提高用药安全性。 □