反义寡核苷酸技术在植物中的应用现状

王 潇

（安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036）

asODN技术是一类经人工合成或构建的反义表达载体，用于表达的寡核苷酸片段，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工、输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。asODN技术首次在抑制肉瘤病毒复制和细胞转化时被提出，之后便逐渐被应用于肿瘤细胞的表达抑制。鉴于植物细胞对asODN片段吸收的限制性，asODN技术在植物上的应用在“糖溶液途径”被证实后在植物基因上的研究才逐步开始，但仍需要对其进行进一步的优化设计，以更好发挥asODN技术的优势。

asODN技术有着独特的优势，主要是对基因进行瞬时沉默抑制，从而研究基因在植物中的功能。此技术一定程度上可弥补其他技术的缺陷，与标记基因相比在对转基因植物进行选择时不改变植物性状或应用于像茶树这类存在转基因难题的植物以沉默基因。因此，asODN技术在研究植物基因方面有很大的应用价值。

1 反义寡核苷酸技术在植物中的研究进展

1.1 糖溶液中植物对asODN的吸收

1978年，Zamecnik等首次提出将asODN技术应用于动物研究，通过特定的寡氧核苷酸片段抑制肉瘤病毒复制和细胞转化。Tridecamer d是一段与13个核苷酸的肉瘤病毒互补的序列，这段序列被添加到小鸡胚胎的纤维细胞组织中培养感染肉瘤病毒，从而抑制了病毒生产。此后，asODN技术开始逐渐应用于动物基因研究[1]。

现有研究已证明植物在糖溶液中可以摄取asODN，所以asODN技术也逐渐应用于植物上了。植物中糖信号通路与细菌、酵母、动物相比还了解甚少，Chuanxin Sun等（2005）基于糖诱导的基因，以SUSIBA2作为转录因子，通过asODN抑制SUSIBA2表达，确定SUSIBA2是植物糖信号传导中的转录激活因子。此研究成功在植物生物学中应用了asODN技术，为验证植物可在糖溶液中吸收asODN奠定了基础。Chuanxin Sun等（2007）发现糖的运输可以向大麦种子提供ODN，并且这种策略可用于通过asODN抑制来抑制胚乳细胞中的基因活性，因此，asODN的糖溶液吸收途径被称作植物细胞中反义寡氧核苷酸的“入境口岸”。Roxanne Y.Walder和Joseph A.Walder（1988）采用设计的寡核苷酸针对小鼠α-或β-珠蛋白mRNA的不同区域进行试验，发现新鲜制备的网状细胞裂解物在有核细胞中含有1%~2%的RNaseH，在活性翻译的条件下，这种活性水平足以在1 h内与互补的寡脱氧核苷酸杂交的位点上裂解几乎100%的目标mRNA，使用poly（rA）·oligo（dT）作为酶的竞争性抑制剂，发现寡脱氧核苷酸与跨越起始密码子的序列或编码区中的序列互补的杂交阻滞完全归因于RNase对mRNA的切割，提出RNaseH对mRNA的切割裂解是主要的抑制途径[2]。

为更好地促进asODN技术在植物上的应用，Chuanxin Sun等（2008）基于已有的研究成果，评论了植物中asODN吸收的特异性机制，即asODN与靶mRNA结合形成的双链杂交体能够激活核糖核酸酶（RNaseH）裂解靶mRNA，进而抑制了蛋白质的翻译与基因的表达。同年，Chuanxin Sun等（2008）总结性地提出ODN抑制是植物细胞中检测基因功能的有效手段，并且采用asODN抑制基因表达的方法，确定了SUSIBA2转录因子在大麦胚乳中调控淀粉合成的重要性，也证明了asODN技术在大麦叶淀粉分支酶活性研究中的适用性。

1.2 asODN技术在植物上的应用

自从植物在糖溶液中能够更好吸收asODN的观点被证实后，asODN能够对基因表达进行选择性抑制的优势被更多地应用于植物基因的研究。

目前，asODN技术在植物上的应用主要分为2个方面，一方面是基于反义寡聚脱氧核苷酸抑制的植物转化选择策略，例如Zhoupeng Xie等（2014）将asODN技术应用于植物转基因研究上所做的实验，取得突破性研究成果。通常转基因植物的筛选是把目的基因和标记基因一起引入细胞，实验中发现引入标记基因可能会带给转基因植物新的性状，如对抗生素、除草剂的抗性，从而引起环境污染、植物性状改变等不利影响，通过asODN的抑制作用选择转化植物细胞则能够很好地解决这个问题[3]。另一方面，asODN技术更多地被应用于对基因进行瞬时抑制，从而验证基因的功能，且大多关于验证有关植物有性繁殖的机理。植物的有性繁殖是雄配子的花粉管伸长并穿透雌蕊实现受精，但这个分子受精的机制还不清楚。Yoko Mizuta和Tetsuya Higashiyama（2014）用无细胞转染素的硫代磷酸脂反义寡脱氧核苷酸在拟南芥花粉管中对基因的功能进行瞬时抑制，用AS-ODN抑制ANX1和ANX2表达的拟南芥花粉管表现出短、打结和断裂的形态特征，而在正义对照中则显示正常的花粉管形态生长[4]。抗荧光蛋白（sGFP）的AS-ODN导致sGFP表达降低，表明AS-ODN抑制了蛋白表达。该方法将能够鉴定拟南芥PT中与生殖相关的重要基因，从而进一步研究分子受精的机制。

自交不亲和（SI）是开花植物出现生殖隔离现象的机制之一，最近的研究提供的相关证据表明S-RNase是非选择性转运到花粉管中的，但未说明这种转运是如何完成的。Dong Meng等（2014）研究发现，苹果（Malus domestica）MdABCF蛋白有助于将S-RNase转运到花粉管中，当MdABCF被反义寡核苷酸转染沉默时，S-RNase无法进入花粉管，认为MdABCF有助于将自身或非自身的S-RNase转运到花粉管中，SRNase转运的阻滞破坏了该系统中的自我不相容性，从而在一定程度上有助于解除植物自交不亲和。基于以上研究，Dong Meng等（2018）利用反义寡核苷酸手段抑制花粉中的MdMYB39L表达，使山梨糖醇合成减少从而使雄蕊发育异常、花粉管生长减少,结果表明山梨糖醇通过苹果中的Md-MYB39L在雄蕊发育和花粉管生长中起着重要作用。HuiJun Jiao等（2019）应用相似的方法，提出PbrPCCP1介导PbrTTS1信号传导从而控制梨中花粉管的生长的观点，发现当通过asODN敲低PbrPCCP1表达水平时，花粉管的生长受到抑制，PbrTTS1的促进作用减弱,PbrPCCP1和PbrTTS1可以共同调节花粉管的生长。

2 结论和展望

asODN技术被首次提出并逐渐成熟应用于动物基因研究上，近年来随着此技术在植物上的应用障碍被逐步突破，asODN技术在植物基因方面研究中的重要意义也凸显出来，在选择转基因植物与验证植物某个基因的功能方面作出了贡献，但在实际实验应用中仍发现一些问题和不足之处亟待解决和优化，如需要对asODN优化设计使其定点作用于特定部位，使靶组织最大效率吸收asODN并尽量降低毒副作用；需要对asODN片段进行化学修饰以提高其稳定性、延长其半衰期、增加其作用时间等；需要逐渐建立起一套稳定的、以asODN技术为基础的基因瞬时沉默体系，以使此技术发挥出更大的优势。