李曼 魏小丽 张丹 俞亚玲 何莎
(陕西省安康市畜牧兽医中心 725000)
生猪产业作为安康市的传统产业,是安康市畜牧业的“支柱”,历经10 余年发展壮大,更成为全市农业和农村经济的“当家”产业。全省畜牧业发展布局是“陕北羊,关中奶,陕南猪”,尤其在新时期脱贫攻坚战役中,生猪产业已成为是安康市是非常重要的产业扶持力量。2018 年8 月非洲猪瘟疫情发生后,安康市畜牧兽医部门持续强化防控措施,防止疫情传入,并取得了阶段性成效,其中安康市市级兽医实验室在疫情监测工作中发挥了巨大作用。但同时也要看到,安康市非洲猪瘟防控还存在一些薄弱环节,各屠宰场虽已配备PCR 仪,能自行开展非洲猪瘟检测工作,但检测水平参差不齐,尤其是各县区兽医实验室及规模养殖场均未取得非洲猪瘟检测资质,导致市级兽医实验室监测压力过大,难以应对新形势下非洲猪瘟常态化防控工作的需要。实验室检测能力建设是非洲猪瘟防控的基石,是精准防控的前提,国家、省、市相关部门虽然一直在鼓励各县区及有条件的养殖场建立PCR 检测室,但在实际建设过程中,由于对非洲猪瘟检测实验室没有统一的建设标准,各县区兽医实验室、屠宰场及企业自检实验室的检测环境、仪器设备、实验室检测人员、检测试剂等方面条件差异较大,造成实验室建设进程缓慢。因此,基层兽医实验室如何合理科学建设非洲猪瘟检测实验室,顺利取得省级授权非洲猪瘟检测资质,尽快开展非洲猪瘟日常排查监测工作,发挥兽医实验室在非洲猪瘟常态化防控工作中的重要作用,是当前防控工作中面临的重要问题。本文就基层非洲猪瘟检测实验室能力建设方面提出一些建议,供广大兽医实验室人员参考。
非洲猪瘟检测实验室必须处于一个相对独立的区域(建有屏障或缓冲区)或相对封闭的区域,其设计不同于基层常见的血清学及病原学实验室,根据PCR 检测方法的原理及特点,非洲猪瘟检测实验室要进行严格分区。由于现在基层多采用商品化试剂盒进行检测,操作较为简单,可根据实验操作过程至少要分隔为试剂准备、核酸提取、扩增分析3 个区域。试剂准备区主要用于样品、试剂存放,离心管、吸头的储存,以及检测样品的前期处理等,核酸提取区主要用于病毒核酸提取,扩增分析区主要用于扩增反应液的配置、核酸荧光PCR 扩增及结果分析。各分区之间应严格按照单一方向进行,各工作区域必须有明确标记。
非洲猪瘟检测实验室必须配备与检测相适应的仪器检测设备,不同区域摆放相应的仪器。试剂准备区应摆放冰箱、水浴锅或加热模块、组织研磨仪、水槽等,核酸提取区应摆放生物安全柜、高速冷冻离心机、混均器、微量加样器等,扩增分析区摆放荧光PCR 仪,电脑、打印机等,除此之外,各区域还应有空调等室内恒温设备、紫外灯消毒设备、专用工作服及一次性手套、离心管等耗材。各区域的设备物品不得混用,各类仪器要有专人管理,仪器技术规程要达到检验项目的要求,重要仪器要制定仪器操作规程及使用记录,严格按照操作规程进行维护,保证其在规定参数内正常运行。
非洲猪瘟荧光定量PCR 检测是以扩增检测DNA 为方法的分子学检测技术,对实验室检测的要求更为严格。实验室应配备具有兽医、医学、生物、畜牧等相关专业专科以上的检测人员1~2 名,经过标准化、系统化的相关法律法规、实验室技术规范、操作规程、生物安全防护知识和实际操作技能等培训,获得资格后方可开展相关检测工作。检测人员要能熟练操作相关设备,明确整个工作流程,掌握实验质量控制方法、检测结果分析及生物安全防护措施。
非洲猪瘟检测实验室人员需进行实验室规章制度培训后方可进入实验室。实验室检测人员必须遵守实验室规章制度。人员进出实验室要做好安全检查,包括水、电、仪器设备、门窗等。与实验检测无关的人员未经允许不得进入实验室。检测工作完成后要对检测结果进行规范记录,原始记录内容要完整,内容要真实,检测报告切实保证时效性、客观性及准确性,相关检测人员及负责人要逐级签字,原始记录及检测报告要及时存档。对实验室的记录和检测结果要实行计算机管理,要有专人负责,将每份实验报告的基本信息录入计算机,并能随时查询。
非洲猪瘟检测实验室要制定实验室所有相关人员的培训计划,并执行周期性的考核和再培训制度,培训内容应涉及核酸提取和扩增操作要点、注意事项、防污染策略及应急预案等,切实保证检测人员的检测技能和水平,凡经考核不合格者不得上岗。定期参加相关部门的盲样比对考核,要结合比对结果认真总结经验,查找不足,采取行之有效的措施,切实提高实验室人员的专业知识、设备维护使用技能、实验操作水平及实验室管理能力,不断提升实验室能力水平,确保检测流程科学规范,检测数据准确可靠。
基层非洲猪瘟检测实验室开展非洲猪瘟检测工作时主要采用商品化的成品试剂盒,目前世面上的检测试剂盒质量参差不齐,检测试剂盒从每盒几百元到几千元不等,核酸检测稳定可靠性尚需存疑。在购买非洲猪瘟病毒检测试剂盒时,不能仅关注价格,应使用已取得农村农业部核发的产品批准文号的非洲猪瘟病毒诊断制品,确保检测结果准确。产品批准文号信息应在中国兽药信息网“兽药基础数据库”中查询。所有未参加或未通过中国动物疫病预防控制中心比对试验的非洲猪瘟病毒诊断制品,以及通过比对试验但目前未申请注册的非洲猪瘟病毒诊断制品一律不能购买使用。
在基层经常见到由于存放不合理影响试剂盒检测灵敏度甚至导致失效的情况,不仅造成很大的浪费,还造成检测工作成为“无用功”,因此,科学有效的试剂管理控制是检测成功的前提。目前常用非洲猪瘟检测试剂盒一般分为A 盒和B 盒,分别为核酸提取试剂盒和扩增试剂盒,要按试剂盒的要求妥善保存试剂,核酸提取试剂盒存放于干燥室温环境,扩增试剂盒和蛋白酶K 存放于-20℃。试剂在使用前放置室温解冻,PCR 反应体系中酶对温度敏感,使用时应置于冰上操作,用完后及时冷冻保存。基层实验室由于检测量不大,每个试剂盒的检测样品数为50 头份,很多时候不能一次用完,也可以将检测试剂进行分装,避免多次冻融影响试剂检测效果。
安全有效的样品管理不仅是保证分析数据质量的需要,也是确保安全的需要。非洲猪瘟采样过程中要避免交叉污染,采样后要做好登记、编号,规范进行保存运输。对于距离较远或其他因素等不能及时送检的样品,应储存于-20℃冰柜冷冻保存。样本送达检测实验室后应做好接样、流转,及时进行检测。对于不能及时开展检测或需要留样的应储存于-20℃冰柜冷冻保存;切不可随意放置。一旦发现疑似阳性或可疑的样品,应妥善包装后尽快送至具有检测资质的实验室检测或上级实验室进行检测样品复核和送检,完成后要对留存的样品进行无害化处理。