肠道病毒71 型疫苗研究进展

毕方川综述 许红梅审校

重庆医科大学附属儿童医院感染科 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 国家儿童健康与疾病临床 医学研究中心 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）

手足口病（hand,foot,and mouth disease，HFMD）是一种常见的儿童传染性疾病，其特征表现为发热，口腔后部多发溃疡及手、足底、臀部丘疹或疱疹，部分危重患儿可出现无菌性脑膜炎、急性弛缓性瘫痪、脑干脑炎、肺水肿、心肺衰竭等严重并发症[1]。HFMD具有高度传染性，可通过粪-口途径、直接接触、间接接触及呼吸道飞沫等途径进行传播[2]。HFMD通常发生于5岁以下儿童，全年均可发生，具有明显的季节分布特点。每年4～8 月份和9～12 月份为亚太地区HFMD流行高峰期[3]。

HFMD 的致病原为肠道病毒，属小RNA 病毒科肠道病毒属，主要有柯萨奇病毒（Coxsackieviru，CV）A 组的4、5、6、7、9、10、16 型和B 组的1、2、3、5 型，埃可病毒（Echovirus）的部分血清型和肠道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）等。EV-A71具有较强的嗜神经毒性，易引发严重的神经系统并发症，是造成重症HFMD的主要病原[4]。

1 EV-A71的流行病学

1969年EV-A71首次在美国加利福尼亚的神经系统感染患儿粪便中被分离。20世纪70年代，澳大利亚、日本相继报道EV-A71流行爆发，随后马来西亚（1986年）、中国台湾（1998年）、中国大陆（2008年）先后报道EV-A 71 相关的HFMD 重大疫情[5]。此外，许多亚太地区国家每2～3 年会经历一次周期性的EV-A 71 爆发。

EV-A 71 分为A、B、C 基因组。A 组为原型EVA 71 病毒株（BrCr-CA-70），B 组分为B 1～B 5 五种亚基因型，C 组分为C 1～C 5 五种亚基因型[6]。1997 年后亚太地区流行的EV-A71以B、C组为主，主要包括B3～B5、C1～C4；1963年至1990年期间，欧美地区流行的EV-A71以B1、B2为主，1990年以后逐渐被C组替代，此后C1、C2成为欧美地区的主要基因型别[7]。

2 EV-A71的结构

EV-A71是无包膜小RNA病毒，直径24～30 nm。EV-A 71 基因组为单股正链RNA，大约由7 411 个核苷酸组成，具有一个完整的开放编码框，可编码大约含2 100 个氨基酸的蛋白，该蛋白可进一步形成P 1、P2、P3三种前体蛋白。P1前体蛋白可裂解形成VP0、VP1、VP3蛋白，VP0进一步裂解形成VP2和VP4蛋白，VP 1、VP 2、VP 3、VP 4 属于结构蛋白，构成病毒衣壳，主要参与免疫应答。P2、P 3 前体蛋白裂解形成2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7种非结构蛋白[8]，主要控制病毒的复制和毒力。开放阅读框的两侧是5’非编码区和3’非编码区，5’非编码区参与基因复制、翻译[6]。EV-A71病毒衣壳由60个结构蛋白原聚体组成，包含VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白，VP1、VP2及VP3位于衣壳外部，VP4位于衣壳内部[8]。

3 EV-A71疫苗

在研的EV-A 71 疫苗包括灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组VP1蛋白疫苗和合成多肽疫苗。目前仅有灭活EV-A71全病毒疫苗完成Ⅲ期临床试验并已广泛应用。

3.1 灭活全病毒疫苗

灭活全病毒疫苗是利用理化方法处理人工大量培养的完整病毒，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。迄今为止，中国大陆、中国台湾、新加坡已开发了完整的灭活全病毒EV-A71疫苗。

科兴生物技术有限公司（Sinovac）、微谷生物技术有限公司（Vigoo）和中国医学科学院医学生物学研究所（CAMS）于2010年至2011年完成灭活全病毒EVA71疫苗的Ⅰ期临床试验，于2013年完成Ⅲ期临床试验，并于2015年获得中国食品药品监督管理局的批准正式投入使用。这三个单位使用不同的病毒株开发疫苗，分别为：H 07 菌株、FY 7 VP 5 菌株、FY-23 菌株，均属于EV-A71 C4亚型，是中国最常见的EV-71A亚型。CAMS使用KMB-17人类二倍体细胞作为细胞库使用细胞工厂扩增EV-A71病毒，Vigoo和Sinovac使用Vero 细胞作为细胞库分别通过微载体生物反应器和细胞工厂扩增EV-A71病毒。三个单位均使用甲醛灭活EV-A71病毒，并添加铝明矾佐剂来制备EV-A71灭活全病毒疫苗。

Sinovac的Ⅲ期临床试验纳入10 077名6～35月龄的婴幼儿，随机接受400 U 灭活EV-A 71 全病毒疫苗（5 044名）或安慰剂（5 033名，ClinicalTrials.gov，编号NCT01507857）。在第1年监测期内，其针对EV-A71相关HFMD 或疱疹性咽峡炎的保护率为94.8%，针对EV-A71相关的住院及神经系统并发症的保护率为100%[9]。其中9 595 名婴幼儿继续随访，第2 年针对EV-A71相关疾病的保护率为95.1%，且两年总体保护率为94.7%。同时还证实，接种疫苗后能针对EVA71不同基因型（B4、B5、C2和C5型）产生交叉免疫，但对CV-A 16 等其他肠病毒相关的HFMD 保护率仅为6.8%，不具备交叉保护能力[10]。其中343名受试者继续随访至5年，仍具有较高滴度的特异性免疫抗体，提示Sinovac EV-A71疫苗具有长期的免疫持久性[11]。两组受试者产生的不良反应相似，最常见的全身不良反应为发热、腹泻和食欲不振，最常见的注射部位不良反应是局部发红、硬化和疼痛。实验期间，共报道242例严重疫苗接种不良事件（疫苗组111例、发生率2.2%，对照组131 例、发生率2.6%），但没有受试者因接种疫苗死亡，提示该疫苗具有良好的安全性[9]。

Vigoo 的Ⅲ期临床试验纳入10 245 名6～35 月龄婴幼儿，分别接受320 U 灭活EV-A 71 全病毒疫苗（5 120 名）或安慰剂（5 125 名，ClinicalTrials.gov，编号NCT 01508247）。在1 年的监测期内，其针对 EV-A 71 相关HFMD 的疫苗效力为90%，针对其他EV-A71相关疾病的疫苗效力为80.4%[12]；在第2年的随访中，针对EV-A 71 相关HFMD 的两年总体疫苗效力为94.42%，第2 年疫苗效力为100%，提示该疫苗能提供持续的保护[13]。实验期间，疫苗组有62例（1.2%）出现严重的不良事件，安慰剂组有75 例（1.5%），两组严重不良事件发生率无显著差异[12]。

CAMS 的Ⅲ期临床试验纳入12 000 名6～71 月龄婴幼儿，分别接受100 U 的灭活EV-A 71 全病毒疫苗（6 000名）或安慰剂（6 000名，ClinicalTrials.gov，编号NCT 01569581）。在第1 年的监测期内，其针对 EV-A 71 相关HFMD 的疫苗效力为97.4%，对CVA16等其他肠病毒引起的HFMD不具有保护作用[14]。

中国台湾研制的灭活EV-A 71 全病毒疫苗采用EV-A 71 临床分离株E 59 菌株（B 4 亚型）[15]。于2019 年启动Ⅲ期临床试验（ClinicalTrials.gov，编号NCT03865238），预计将于2022年完成。新加坡使用B3亚型，已完成Ⅰ期临床研究[16]。

以上研究表明，灭活EV-A 71 全病毒疫苗具有良好的保护性和安全性，但仅能预防部分EV-A71感染，仍需进行进一步研究。

3.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是通过将微生物的自然强毒株通过物理、化学或生物学等方法进行处理而制成的疫苗，减毒活疫苗丧失致病力或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性。

研究者参照脊髓灰质炎病毒减毒的策略对 EV-A 71 BrCr 株基因组5’非编码区、3 D基因和3’非编码区进行变异，得到EV-A 71 减毒株（S 1-3’）。接种了EV-A 71（S 1-3’）的食蟹猴可在致死剂量的 EV-A 71 攻击下存活，产生针对EV-A 71 不同基因型（A、B1、B4、C2和C4型）的中和抗体，但部分猴子接种疫苗后出现震颤，并在脊髓中分离出减毒病毒[17]。研究表明，EV-A71减毒活疫苗是可行的，但应该进一步改善疫苗的安全性。近年来出现了一种使用密码子去优化病毒制备减毒疫苗的方法，研究者将病毒特定氨基酸对应优选密码子替换为与之对应的最不优选密码子，使其双核苷酸CpG和UpA水平升高，从而降低病毒的毒力及生存能力[18]。研究显示，通过对病毒3D RNA聚合酶的L123F和G64R两处氨基酸位点进行修饰，构建高保真的EV-A 71 减毒株，接种该减毒株小鼠产生针对EV-A71的特异性中和抗体且未产生体质量减轻、瘫痪、死亡等严重不良反应。提示该减毒株具有较高的免疫原性及较低的毒力[19]。密码子去优化是一种开发安全稳定的减毒疫苗的新方法。

3.3 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，在形态特征和抗原性上与天然病毒颗粒相似，具备激发宿主免疫反应的能力。VLP 不含病毒基因组，不能自发复制感染，是构建候选疫苗的安全 之选。

基于制备脊髓灰质炎病毒VLP疫苗的经验，可构建昆虫细胞-杆状病毒表达系统，制备EV-A71 B5亚型VLP疫苗。该疫苗能诱导恒河猴产生高水平的针对EV-A71不同亚型（B4、B5、C2和C4亚基因型）的特异性抗EV-A71病毒IgG和IgM，阻止EV-A71在恒河猴中传播[20]。除杆状病毒表达系统外，EV-A71 VLP 还可以在酵母中产生，使用毕赤酵母表达EV-A 71 VLP，能有效诱导小鼠产生针对同源和异源EV-A 71株的中和抗体，还能通过母体免疫保护新生小鼠免于EV-A71攻击[21]。EV-A71 VLP疫苗具有良好的保护效果，具较高安全性且易于制备，是优质的EV-A71候选疫苗，但VLP疫苗的生产成本较高，产量相对较低，仍需进一步改进。

3.4 重组VP1蛋白疫苗

病原体引起免疫反应的主要成分是抗原蛋白上的抗原决定簇，抗原决定簇是由数量不等的抗原表位组成。EV-A71的主要抗原表位大多位于VP1蛋白。

将重组杆状病毒Bac-Pie1-gp64-VP1转入昆虫细胞后成功表达了C4亚基因EV-A71的VP1，这种VP1蛋白与原始病毒VP 1 蛋白具有相同的形态结构及免疫原性。小鼠接种这种重组蛋白后能产生高滴度的针对EV-A71病毒所有基因亚型的中和抗体[22]。研究显示，通过基因重组技术获得包含gag蛋白（人免疫缺陷病毒结构性多蛋白Pr 55 gag 的前体蛋白）和EV-A 71 VP1 蛋白的VLP（gag-VP1 VLP）。这种疫苗能诱导小鼠产生强烈的体液和细胞免疫反应，还能通过母体免疫保护新生小鼠免受致命剂量EV-A71的攻击[23]。以上研究表明，重组VP1蛋白疫苗能同时诱导体液和细胞免疫应答，并能对不同亚基因型的EV-A71产生交叉中和作用，具有较好的发展前景。但VP1蛋白疫苗的保护作用仍需进一步强化。

3.5 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的一类疫苗。这种疫苗通过人工合成病原微生物的保护性多肽或抗原表位，并辅以适当的载体与佐剂而制成的一种新型基因工程疫苗。

EV-A 71 病毒上的多肽SP 70 位于VP 1 蛋白，是EV-A71的主要中和表位的重要组成之一。研究显示，利用B 4 亚基因型EV-A 71 的SP 70 免疫小鼠，小鼠可产生同原病毒免疫相似效价的特异性IgG，且能对B2、B5、C2、C4亚基因型病毒产生交叉免疫反应[24]。抗SP70血清能对同源及异源EV-A71（B2、B4、B5、C2、C4）的攻击提供较强的保护作用[25]。

研究发现，CV-A16抗原表位PEP71能诱导小鼠产生针对同源和异源CV-A 16 菌株的中和抗体；且CV-A16 的SP70肽的氨基酸排列与PEP71高度重叠，提示SP 70 可能同样具有开发通用CV-A 16 疫苗的潜力[26]。基于此研究，将EV-A 71 VLP 中的SP 70 肽替换为CV-A 16 的SP 70 肽，设计一个嵌合的EV-A 71 VLP（ChiEV-A71 VLP）。这种疫苗能诱导小鼠产生针对EV-A 71 和CV-A 16 的特异性体液免疫，还能诱导小鼠脾细胞IFN-c，IL-2，IL-4和IL-6显著升高，激活小鼠针对EV-A71的有效细胞免疫应答；小鼠注射抗ChiEV-A71血清后可在致死量的EV-A71和 CV-A16攻击下存活。研究提示，抗ChiEV-A71血清能同时具有针对EV-A71和CV-A16感染的保护作用[27]。

合成肽疫苗具有较高的特异性、较好的免疫原性和保护性。通过研究不同抗原肽的保护作用，并选择不同抗原肽嵌合肠道病毒VLP 制备疫苗的方法可能是制备多价HFMD疫苗的新思路。

综上，EV-A 71 是最具致病性的肠道病毒之一，虽然我国研发的EV-A71灭活疫苗已批准上市，但该疫苗仍需进行进一步的远期评估。同时也要继续深入研究减毒活疫苗，病毒样颗粒疫苗、重组VP1蛋白疫苗、合成多肽疫苗等新型疫苗，需在保证疫苗安全性的前提下，进一步提高其保护效力及生产能力。同时，除EV-A 71 以外，CV-A 16 和近年来新兴的肠道病毒如CV-A6、CV-A8和CV-A10等也与HFMD的暴发有关[28-30]。因此研制预防多种肠道病毒感染的联合疫苗将是预防HFMD疫苗的重要研究方向。