干细胞移植治疗阿尔茨海默病的研究进展

衣红杰，王蕾，孟庆松，王海峰

(1.山东中医药大学，济南 250014；2.山东中医药大学第二附属医院神经内科，济南 250001)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和行为损害为特征的神经退行性疾病，其起病隐袭、进展缓慢，临床表现为记忆功能障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为异常等。AD病理复杂，其发病机制主要有胆碱能假说、Tau蛋白学说、淀粉样蛋白级联学说等，但随着研究深入，学者还提出了多种假设：线粒体功能障碍[1]、小胶质细胞和星形胶质细胞等介导的免疫损伤[2-4]、载脂蛋白Eε4等位基因的变异[5]等引起的病理改变。其主要病理特征为淀粉样斑块和神经原纤维缠结；此外，还可见神经束丝、纤细的轴突、伴发的星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化[6]。这些病理过程的发展结果包括神经变性、突触丢失和神经元肉眼可见的萎缩。因此，临床抗AD药物或抗体的研发主要集中在抗氧化、清除脑中的β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积以及调节Tau蛋白的磷酸化三个方面[7-9]。目前，普遍使用的治疗药物为胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体选择性拮抗剂，此外还有石杉碱甲和奥拉西坦等，但不管何种药物，均是通过消除或阻止淀粉样蛋白沉积和过度磷酸化的Tau蛋白来缓解AD患者症状，而不能修复其退化的神经元，同时还存在不可避免的不良反应。虽然近年针对AD的病理了解更深入，但仍未研发出针对此病的具体靶点药物，不能逆转病程发展，因此干细胞移植治疗应运而生。现就干细胞移植治疗AD的研究进展予以综述。

1 干细胞移植简述

20世纪80年代，Lindvall等[10]首次将干细胞移植应用到帕金森病中，并取得了良好的治疗效果；随后学者逐渐将该技术应用于其他变性病中，如AD、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病[11]。干细胞具有无限或长期的自我更新能力，且可以朝某一方向分化，在体内外均可被诱导分化为神经元，其为从根本上治疗AD提供了新的可能[2]。按不同的发育阶段分类，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞。目前，研究较广泛的干细胞主要有间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神经干细胞(neural stem cells，NSCs)、ESCs和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)。干细胞种类多样，来源广泛，易于分离，可操作性高，选择合适的干细胞类型，可部分或完全避免免疫排斥反应带来的移植后并发症，降低移植风险。

2 干细胞移植在治疗AD中的应用

2.1MSCs MSCs是从骨髓、脐带、脂肪组织、外周血、羊水、肌肉、肺等器官和组织中分离出来的多能细胞[12-13]，没有严重的伦理或技术问题。MSCs是一组专能干细胞的总称，具有易于分离和获取、高度增殖性、可分化多种类细胞，以及调节机体免疫功能的特点[2,14]，临床常将其作为干细胞移植治疗的首选干细胞类型。目前，以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)等研究最为普遍。

2.1.1BMSCs 已有研究表明，神经炎症是导致AD认知障碍的主要原因之一[15]。小胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞之一，在神经炎症中起重要作用。现在大量关于干细胞移植治疗AD的研究均将小胶质细胞作为靶点。小胶质细胞具有促炎和抗炎作用，促炎因子会加重中枢神经系统的损伤，但抗炎因子会帮助改善神经功能[16-17]。AD患者脑内可见活化的小胶质细胞，小胶质细胞是Aβ斑块的一种有效激活剂，可通过慢性促炎反应作用于Aβ斑块，加快Aβ沉积。而Aβ又可以激活小胶质细胞产生细胞因子和神经毒素，导致神经元损伤和突触丢失，促进神经变性[18]，由此形成恶性循环。小胶质细胞可以通过转换表型使其抗炎作用占主导地位，而这种转换需通过干细胞移植实现。将BMSCs移植入淀粉样前体蛋白的小鼠海马实验显示，BMSCs能够通过激活小胶质细胞、缓解Aβ斑块形成减少沉积和Tau蛋白的磷酸化，抑制神经毒性，且通过神经营养因子分化为神经元样细胞，改善小鼠的认知功能[19-23]。同时BMSCs在移植后产生了多种神经保护剂，包括神经营养生长因子、趋化因子和细胞因子，对神经起重要的保护作用[24]。

2.1.2UCMSCs 脐带是一种省时省力、非侵入性的干细胞来源，脐带血中原始细胞较多，易于收集，与其他来源的MSCs相比，UMSCs自我更新及分化能力更强，致瘤性和免疫原性更低，且规避了伦理问题。

星形胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞，在大脑的一系列神经发育和动态平衡过程中发挥重要作用，包括建立和维持突触、细胞外神经递质水平，以及维持血脑屏障正常功能[25-27]。脑源性神经营养因子修饰的UCMSCs移植到AD大鼠模型中可以增强星形胶质细胞的激活，减少Aβ的表达，并改善空间学习和记忆能力[28]。有研究显示，移植神经元样UCMSCs显著增加了突触蛋白-1的表达，突触蛋白-1是突触功能成熟和神经递质释放的重要蛋白，由此改善突触传递，加强神经递质的释放[29]。有临床试验显示：将UCMSCs移植到AD患者双侧海马和一侧楔前叶，受试者没有出现不良反应，后期也没有肿瘤形成及其他异常，但Aβ检测显示负荷并没有改善，这一结果与上述动物实验中UCMSCs能够缓解Aβ斑块形成的作用相悖[30]。以上研究表明，UMSCs的移植效果可能与检测方法、脑内微环境甚至物种发展有关，即低级物种接受高级物种干细胞移植效果更好。

MSCs主要通过重建神经微环境，减少损害正常神经结构的因素(如减少Aβ的堆积)来支持神经生长、促进神经元的恢复，从而达到缓解和治疗AD的目的[4,31-32]。MSCs主要以静脉应用透过血脑屏障到达损伤部位[20，33]。在使用干细胞移植治疗脑损伤的临床前研究中，已经试验了几种不同的给药途径，包括脑室注射、腹腔注射、静脉注射、鞘内注射、鼻腔注射和大脑皮质实质内注射。一项研究对静脉移植和实质内移植MSCs治疗脑缺氧损伤的差异进行比较发现，静脉注射较实质内注射具有更好的效果[34]。

上述研究结果表明，使用MSCs并了解它们的细胞和分子作用机制对AD的治疗有很大帮助；与ESCs或IPSCs相比，MSCs免疫应答低，并发症少。虽然MSCs在细胞移植治疗中应用多样，但其分泌的因子类型和细胞信号转导通路还不是很明确；同时需要一种更有效的方法提高MSCs利用率。一旦确定MSCs治疗AD的机制和有效的使用方法，MSCs治疗很有可能进入临床实践，成为最有前景的治疗AD的干细胞类型。截至目前，UCMSCs的安全性和有效性已得到诸多临床前和临床试验的验证，因此UMSCs或可成为干细胞移植治疗AD的首选。

2.2NSCs NSCs是一种自我更新能力强且具多向分化潜能的神经祖细胞，主要来源于胚胎或胎儿神经组织。随着研究深入，现已发现NSCs也出现在成鼠的纹状体、海马齿状回，人脑的嗅球、侧室壁、大脑白质和海马等哺乳动物中枢神经系统的部位，其中成人海马的粒下区和脑室侧壁室下区的NSCs[2，35]不仅能分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞[36],且具有高迁移、高播散及低免疫原性的特点[2]。

海马和皮质的胆碱能神经元减少，是目前公认的引起AD认知障碍的主要原因。NSCs广泛参与哺乳动物大脑的动态平衡和修复，并表现出多效性的固有特性，这可能使其成为治疗AD有潜力的候选细胞。一项使用人神经干细胞治疗颅脑放疗不良反应的试验表明，注射人神经干细胞恢复了放疗后海马区神经元的可塑性[37]；研究显示，NSCs移植显著改善了记忆障碍和空间学习能力[38]。NSCs移植治疗AD主要通过内源性和外源性两种途径达到修复和代替受损的神经细胞，重建细胞环路、改善细胞功能的目的。

内源性NSCs疗法即当发生神经元损伤或变性时，利用自身的NSCs，动员静止的神经干细胞[39-40]，诱导其增殖与分化，使受损伤的中枢神经系统进行修复。该方法相较其他细胞替代疗法具有可避免免疫反应、减少肿瘤发生以及不涉及伦理问题等优势，同时内源性NSCs拥有针对环境的变化调整增殖与分化速度的潜力，且这种能力并不局限于正在进行神经组织生成的区域。因此可以用各种干预手段对内源性NSCs进行调整和改善,促进其激活与增殖，最终迁移至靶区进一步分化整合[41]。然而，这种内源性神经发生不能抵消受损大脑中神经元的丢失。此外，神经退行性患者逐渐失去神经元，不能产生新的神经元来取代丢失的神经元[42-43]。

外源性NSCs疗法主要是通过移植的方法，使其在体内存活、迁移并分化为功能性神经元，整合入宿主神经回路，修复神经功能[44-45]。有学者将胎儿端脑内的人神经干细胞移植到AD小鼠侧脑室中，观察到人神经干细胞在侧脑室中分化为神经元和胶质细胞，这一过程可以改善空间记忆，减少Tau蛋白磷酸化和降低Aβ42水平、减少小胶质细胞病和星形胶质细胞病、增强内源性突触发生以及增加神经元、突触和神经纤维密度[46-47]。这些作用通过信号通路的调节、代谢活性、抗炎因子的分泌和细胞与细胞的接触等机制实现。脑源性神经营养因子能够改善海马突触密度和增加胆碱能神经元数量[48-51]，对移植NSCs改善AD大鼠的认知至关重要。此外，外源性NSCs在受体脑组织的病灶内迁移并分化为相应神经元的过程中，其分化方向与NSCs的内在和所在的微环境密切相关。

以上两种途径的研究表明，虽然外源性NSCs在治疗AD中效果明显，但其机制是NSCs分化的神经元替代了缺失组织，还是NSCs分泌的细胞因子或移植的NSCs激活了某些信号通路促进了神经发生[52]，目前尚不清楚；内源性途径虽在一定程度上避免了免疫原性和伦理限制[53]的问题，但这两种途径均存在的重要缺陷为将NSC移植入成体中枢神经系统非神经元部位，绝大部分细胞因为受体脑内微环境影响并不向神经元方向分化，分化条件无法掌控，在脑内存活数量不足[11,54]。NSCs移植可以补充AD患者缺失的神经元，但因目前医学技术的局限，仍无法精确提高NSCs的体外行为与其对脑环境的适应度，故还需要广泛的基础研究。

2.3ESCs ESCs是胚胎发育囊胚期的多能干细胞，被称为“最原始”的全能干细胞，ESCs从外胚层、中胚层和内胚层产生体细胞及具有自我更新的能力，决定了其多能性,可以诱导分化为任何方向的细胞[2,55]。

基底前脑胆碱能神经元在AD患者脑中受到严重破坏，将小鼠ESCs成功分化产生的基底前脑胆碱能神经元移植入AD大鼠脑中后，其虽然推动了大鼠脑中神经元的衍生，明显改善了记忆，但也出现了鼻咽癌的分化[56]。有研究将人ESCs在体外产生的胆碱能神经元，移植到培养的小鼠内嗅海马切片上，发现它们可以和现有的神经元网络相连[57]，达到改变认知的效果。美国食品药品管理局批准的第一个使用人类ESCs衍生细胞的临床试验于2010年由Geron公司启动，标志着设计人ESCs移植的临床试验正式启动。虽然ESCs具有许多优点，但为了达到研究目的，ESCs多是从体外受精的卵子中发育出来的胚胎获得，由此引发的伦理问题和潜在的免疫排斥反应使其临床应用存在较大争议，且直接移植ESCs存在分化方向难以调控、细胞增殖失控[2，56]和肿瘤发生、胎瘤形成等问题[58-59]。因此需要更新的方法改善供体细胞和受体的相容性，防止潜在的免疫反应[60-61]。

2.4IPSCs IPSCs的原理是通过向体细胞中转入若干转录因子，使其逆向重编程回到ESCs样状态具有干细胞的基本特性[62]。除来源外，IPSCs的其他特征与ESCs几乎完全一致，具有多项分化潜能，并能够在体外自我更新，理论上可以诱导分化为成体生物体内的所有细胞类型。IPSCs通过特定的重编程基因的传递，各种类型的体细胞(如皮肤成纤维细胞和外周血单核细胞)可通过诱导达到类似ESCs的状态，发挥ESCs的作用。因此，IPSCs技术可以解决与使用ESCs有关的短缺和复杂的社会问题。借助IPSCs可以从患者自身产生多能细胞，进行自体移植，解决免疫排斥反应和伦理限制的问题[63]。将人IPSCs诱导分化为神经元细胞，并移植到具有Aβ沉积和空间记忆障碍的小鼠海马中，观察到细胞分化为胆碱能神经元，且记忆障碍有所好转[64]。

目前国内外学者对IPSCs的研究时间尚短，研究过程受技术等条件限制，IPSCs的应用仍面临许多挑战，如如何概括散发性疾病的表型，以及如何选择理想的表型和进行大规模药物的筛选。但现在已经开发了许多新策略，可以与以IPSCs为基础的模型相结合来解决这些问题，包括有机体技术、单细胞RNA测序、基因组编辑和深度学习人工智能等[65]。

3 问题与展望

迄今为止，多种动物实验、体内外实验结果表明，干细胞可以有效填补AD患者丢失的神经元，为AD的治疗提供新思路[2,29,37]；同时，通过研究干细胞诱导激活分化为神经元的机制，还可以进一步明确神经元的产生与凋亡机制，为AD的病理研究提供新领域。

但目前仍缺乏对干细胞移植后脑修复因素的分析研究，在如何消除免疫排斥反应、提高移植干细胞存活率、获得有效临床级数量、获得活化年轻的干细胞、选择给药途径以及防止回输后干细胞适应脑内微环境等方面面临巨大挑战。目前，有关应用干细胞移植技术治疗AD的研究大多停留在动物模型实验阶段，其临床应用较少。未来的临床前研究应特别强调安全性，确定最佳的细胞来源和输送方法，并积极评估AD患者脑内微环境中干细胞的分化反应，积极随访。

4 小 结

AD发病率逐年上升，目前尚无有效治疗手段，干细胞移植可能成为一种治疗AD的有效方法。丰富的动物实验为临床试验提供了可靠的理论依据，提高干细胞移植在临床的可行性。干细胞种类多样，其中MSCs以其易获取、可自我更新、多向分化等特点成为首选干细胞类型。但干细胞的作用机制仍未完全阐明，人类临床试验仍处于初起阶段，为使更多AD患者获益，需建立完备的动物实验和临床试验的数据标准，反复验证其安全性、有效性，准确把控伦理问题，尽早实现干细胞移植治疗AD。