噬菌体抗体库分类与筛选方法的研究

张 媛，常思源

（1.南京钟鼎生物技术有限公司研发部，江苏 南京 210034 ；2.南京科技职业学院生命健康学院，江苏 南京 210048）

噬菌体是能够侵袭细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的一类病毒的总称。噬菌体的基因组中含有许多个基因。所有已知的噬菌体均是由细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。噬菌体具有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主的菌体内。噬菌体抗体库技术是一项新的基因工程抗体制备技术。该技术在人源性抗体克隆、抗体技能改造、抗体基因研究等方面发挥着重要的作用。在对噬菌体抗体库进行筛选的过程中，按照噬菌体抗体库的具体分类选择合适的筛选方法尤为重要。通过聚合酶链式反应（PCR）等基因工程的方法，能够对噬菌体进行扩增，以获得抗体的可变区和/ 或恒定区，然后利用酶连或重组技术将目的基因构建至特定的噬菌粒载体中，使外源基因与噬菌体的核衣壳蛋白Ⅲ或Ⅷ融合表达,进而可直接展示在噬菌体核衣壳表面获得的噬菌体抗体库。有研究表明，外源多肽或蛋白的基因主要与噬菌体的DNA 融合表达，基因与表型之间是一一对应的关系。因此，直接通过对筛选获得的噬菌体DNA 进行一代测序即可获得抗体基因序列的具体信息，进而为新药及疫苗的研制奠定基础[1]。本研究主要是探讨噬菌体抗体库的分类与筛选方法。

1 噬菌体抗体库的分类

按照抗体库的来源可将噬菌体抗体库分为免疫噬菌体抗体库和非免疫噬菌体抗体库两大类。免疫噬菌体抗体库来源于经过免疫接种动物的组织或血清。非免疫噬菌体抗体库来源于未经过免疫接种动物的组织或血清。非免疫噬菌体抗体库除了可直接通过动物的组织或血清获得，还可通过半合成或全合成的方式获得[2]。

1.1 免疫噬菌体抗体库

免疫噬菌体抗体库是指从获取细胞免疫或体液免疫(包括但不局限于注射疫苗、感染微生物、罹患肿瘤性疾病等)后的个体上获得的抗体库。通过免疫压力的筛选，可大大地增加免疫噬菌体抗体库中特异性抗体的丰度，不需要很大的库容即可筛选到针对特异性抗原的抗体。目前，市面上有大量的商业化免疫抗体库制备试剂盒，包括Amersham Pharmacia的RPAS 小鼠ScFv 库构建试剂盒。该试剂盒是从RPAS 小鼠脾脏或骨髓瘤细胞中扩增获得的ScFv 基因库。该试剂盒不适用于检测弱免疫原性的抗原、免疫个体自身的抗原或者有毒性的抗原,其应用受到一定的限制。

1.2 非免疫噬菌体抗体库

免疫噬菌体抗体库是从获取细胞免疫或体液免疫后的动物组织中扩增获得特异性抗体，而非免疫噬菌体抗体库是不需动物获取细胞免疫或体液免疫后获得的抗体库。按照噬菌体抗体库可变区的组成情况，非免疫噬菌体抗体库可分为以下3 类：1）天然噬菌体抗体库。天然噬菌体抗体库中所有抗体库的可变区均来源于未经免疫动物的B 淋巴细胞。2）半合成噬菌体抗体库。此类抗体库中一部分可变区的序列是通过人工化学合成获得，另一部分可变区的序列则来源于未经免疫动物的B 淋巴细胞。3）全合成噬菌体抗体库。抗体库中所有可变区的序列均是通过人工化学合成的方式获得。在构建非免疫噬菌体抗体库的过程中，所有抗体的来源均可不经过细胞免疫或体液免疫的作用。因此，非免疫噬菌体抗体库中针对特异性抗原的抗体的比例较低。Mondon 等[3]的报道中称，2007 年非免疫噬菌体抗体库的库容已经普遍达到了1011的水平。从理论上分析，只要非免疫噬菌体抗体库的库容足够大，就可以筛选到任何特异性抗体，但为了获得针对特异性抗原的抗体，建议构建特异性非免疫噬菌体抗体库。

2 噬菌体抗体库的筛选方法

噬菌体抗体库筛选方法的选择，可在很大程度上决定能否从其中筛选出所需的特异性抗体。影响噬菌体抗体库筛选过程的因素包括（但不局限于）以下情况：抗体库本身的库容、重复率、存放条件、扩增方法及筛选方法[4]。噬菌体抗体库筛选方法的选择，需根据所需抗原的具体性质而定。按照筛选抗原的纯度，噬菌体抗体库的筛选方法可分为纯化抗原筛选法和非纯化抗原筛选法两大类。

2.1 纯化抗原筛选法

纯化抗原筛选法是指采用纯化过的抗原进行抗体库筛选的方法。该筛选法具有效率高、特异性强、流程简单等特点，是目前被普遍使用的噬菌体抗体库的筛选方法。纯化抗原筛选法分为固相筛选法和液相筛选法两种：1）固相筛选法是将纯化后的抗原，直接包被在酶标条或免疫管等固相介质上投入抗体库中，经过若干轮的筛选、富集后获得特异性抗体的方法。固相筛选法具有操作简单、特异性强等特点，是最常用的抗体库筛选方法。2010 年Han DG 等[5]采用固相筛选法对噬菌体抗体库进行了4 轮的筛选、富集后，成功地获得了抗EGFRv Ⅲ的特异性噬菌体抗体库。在采用固相筛选法对噬菌体抗体库进行筛选时，可通过多种调整包被密度及洗脱强度的方法获得不同亲和力的抗体，且包被的密度越高、洗脱的强度越大，获得抗体的亲和力就越高。在采用固相筛选法对噬菌体抗体库进行筛选时，还可通过增加竞争性抗体的方法进行筛选调整。2001 年Bracci等[6]将烟碱乙酰胆碱受体增加到筛选体系中，使其与噬菌体抗体进行竞争性筛选后，获得了抗蛇毒的 sc Fv 抗体。固相筛选法的缺点是：⑴由于抗原的包被附着在固相介质的表面上,部分表位极易受到影响而丢失特异性抗体。⑵在对抗体库进行筛选的过程中，对抗原的需求较大,较难根据抗体、抗原的性质进行相应的量化处理。2）液相筛选法。目前，在对噬菌体抗体库进行液相筛选时，一般采用以下两种方法：⑴对抗原进行生物素标记，再利用生物素与链霉亲和素相结合的原理，将抗原包被在偶联的链霉亲和素磁珠上，然后对噬菌体抗体库进行筛选。⑵对抗原进行生物素标记后，将其放入噬菌体抗体库中，让抗原与抗体进行配对结合，将反应后的产物加入到偶联的链霉亲和素磁珠中进行筛选。与固相筛选法相同，液相筛选法也可通过多种调整包被的密度和洗脱的强度获得亲和力不同的抗体，且包被的密度越高、洗脱的强度越大，获得抗体的亲和力就越高。与采用固相筛选法相比，采用液相筛选法对噬菌体抗体库进行筛选的优势是：1）抗原和抗体的运动相对自由，可使其结合得更加充分。2）抗原在液相环境中能够保持自身的空间构象，可避免受到抗原表位的影响。液相筛选法的缺点是：⑴在对抗原进行生物素标记时，一些潜在的、能够与特异性抗体结合的抗原表位可能出现失活的现象。⑵偶联在磁珠上的链霉亲和素可能会与非特异抗体相结合。陈瑛炜等[7]将带有His-tag的抗原与噬菌体抗体库进行混合反应后,再将反应产物通过镍柱进行纯化洗脱,获得了特异性噬菌体抗体，从而解决了上述问题。

2.2 非纯化抗原筛选法

非纯化抗原筛选法包括细胞筛选法和组织或体内筛选法两种。1）细胞筛选法。在无法获得足够量的抗原或抗原的免疫原性较弱、性质不确定时，不能直接采用抗原-抗体结合的方式进行筛选，需采用完整的细胞对噬菌体抗体库进行筛选。由于完整细胞的膜蛋白、表面蛋白可以保证抗原维持完整的天然构象，故采用完整的细胞对抗体库进行筛选获得的抗体更符合后续的需求。在采用细胞筛选法对抗体库进行筛选时，可使用贴壁细胞或悬浮细胞。采用贴壁细胞对抗体库进行筛选的过程与采用固相筛选法对抗体库进行筛选的流程类似。采用悬浮细胞对抗体库进行筛选的流程与采用液相筛选法对抗体库进行筛选的流程相似。虽然细胞筛选法更加符合蛋白的天然构象，但因细胞的表面存在大量的非相关蛋白质、脂类、糖类等其他成分，可能会发生目的蛋白与非特异性噬菌体抗体相结合的现象。一般情况下，目的蛋白在细胞表面的含量较低，如进行筛选的批次较多，则易丢失特异性抗体。2008 年Taipa 等[8]采用磁性细胞分选器（magnetic cell sorter，MACS）对细胞进行分选，方法是：将阳性细胞包裹在MACS 中的磁珠上，加入大量的阴性细胞，再加入能够与特异性噬菌体结合的阳性细胞，随后通过磁珠快速地进行分离筛选。2）组织内或体内筛选法。细胞培养存在一定的局限性，许多细胞往往无法进行体外培养。部分细胞虽可进行体外培养，但体外环境的改变会使细胞膜表面的蛋白发生变化，使其与在体内环境中培养的膜蛋白构象出现较大的差异，进而无法有效地观察到抗体的结合。与进行体外筛选相比，在组织内或体内对噬菌体抗体进行筛选，能够保持抗体本身自然的三维环境，更加适用于对肿瘤组织及器官上细胞特异性标志物的抗体进行筛选[9]。有研究表明，将待筛选的噬菌体抗体通过尾静脉注射的方式注入到小鼠的体内，这些抗体会通过小鼠自身的血液循环作用分布至其全身，其血液中的非特异性抗体会逐渐被稀释、清除，而特异性抗体则能够结合在不同的组织、器官中。通过分离其相应的组织或器官的细胞可对特异性抗体进行洗脱、富集，获得特异性噬菌体抗体。2000 年Johns 等[10]通过组织内或体内筛选法成功地从内皮细胞中获得了特异性噬菌体抗体库。1997年Tordson 等[11]采集了黑色素瘤的组织样本，将其制备成冰冻组织切片，通过几轮的平移后进行筛选、富集，获得了针对黑色素瘤的特异性噬菌体抗体库。但是，组织内或体内筛选法具有一定的局限性，即进行筛选的过程无法在体内完成，故不能对非特异性结合位点进行封闭处理，致使抗体与组织结合的背景复杂，随意性较强。

3 小结

噬菌体抗体库技术具有操作简单、高效等特点，其应用的前景广泛。目前，筛选噬菌体抗体库的方法虽然较多，但这些筛选方法的效率却普遍不高。因此，需在今后的研究中进一步优化噬菌体抗体库的筛选方法，以提高筛选噬菌体抗体库的效率，进而为新药的研发及疫苗的研制提供帮助。