骨肉瘤相关小干扰RNA研究进展

邵帅铭 徐宁 徐佳元 刘维宇 杨卫良

骨肉瘤是一种常见的间充质来源的原发性骨恶性肿瘤，好发于青春发育期，在老年人中还有第2个小高峰[1]。该疾病好发于于脊柱、骨盆和骶骨，且单发病灶患者占大多数，恶性程度较高，早期极有可能发生肺转移。随着治疗理念与化疗水平的改进，骨肉瘤生存率已由原先的不到30%升高到70%以上，但近几十年来疗效上没有本质上的提高，尤其是对转移患者[2]。RNA干扰技术是利用双链RNA高效、特异性地降解细胞内同源信使RNA，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型[3]。小干扰RNA(siRNA)也被称为短干扰RNA、沉默RNA、非编码 RNA，它是生物宿主对外源侵入基因表达的双链RNA进行切割所产生具有特定长度(21～25 bp)和特定序列的小片段RNA。这些siRNA可以单链形式与外源基因表达的mRNA相结合，并诱导相应mRNA降解[4]。siRNA 可用于沉默与肿瘤发生转移有关的基因、与肿瘤信号转导通路相关基因、抗癌药物敏感性相关基因、肿瘤细胞凋亡相关基因，以此来降低肿瘤恶性程度，提高患者预后水平[5]。本文就骨肉瘤相关小干扰RNA 研究进展进行综述。

1 siRNA对骨肉瘤的调控

1.1 抑制骨肉瘤血管生成

血管内皮生长因子(VEGF)是重要的促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用，可增加血管通透性，促进细胞迁移等[6]。研究表明，骨肉瘤是一种血运丰富的恶性肿瘤，VEGF高表达与其恶性程度及肺转移相关[7]。缺氧诱导因子-1(HIF-1)可调节肿瘤关键基因的转录，激活VEGF基因。Zhang等[8]通过调节VEGF表达对骨肉瘤细胞的影响研究HIF-1，将含有HIF-1 siRNA的质粒转染骨肉瘤细胞SaoS-2，发现被转染的细胞中VEGF蛋白含量及mRNA表达被明显抑制。研究表明，巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)可募集肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，而TAM会进一步释放VEGF，从而促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤发展[9]。叶凯山等[10]将siRNA-CSF-1转染骨肉瘤细胞SaoS-2，并应用蛋白免疫印迹法检测细胞中同种异体移植炎性因子-1(AIF-1)和 Ras 相关C3肉毒素底物-1(Rac-1)的表达，发现转染后细胞中 AIF-1 和 Rac-1 表达水平均下调；收集转染后细胞上清液制成条件培养液，培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，结果显示HUVEC增殖、迁移及小管形成能力均显著降低，且VEGF和 Rac-1表达水平下调，证明干扰CSF-1表达可能通过抑制AIF-1/Rac-1信号转导通路调控VEGF表达，从而影响肿瘤血管生成，抑制骨肉瘤生长。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成员，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞分化增殖及浸润转移密切相关。Gu等[11]使用双重siRNA同时沉默VEGF和Survivin，发现与单独抑制VEGF或Survivin相比，双重siRNA可更显著地抑制肿瘤血管生成，且与单靶siRNA沉默单基因相比，双重siRNA沉默2种基因的相关作用显著增强。

以上研究证明，构建VEGF及其相关基因的siRNA可抑制骨肉瘤血管新生，从而调控骨肉瘤发生发展，有望为骨肉瘤提供一种新颖的治疗策略。

1.2 抑制骨肉瘤细胞增殖

研究表明，CBX3、PLK1等细胞因子及Janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活子(STAT)等信号转导通路可调控骨肉瘤细胞增殖[12]。JAK/STAT信号转导通路及STAT3和STAT5持续激活可影响肿瘤细胞存活、增殖和侵袭，从而使JAK/STAT信号转导通路成为药物开发和癌症治疗的首选靶标[13]。研究证实， STK35在骨肉瘤细胞中较正常骨细胞中明显过表达，将STAT3 siRNA转染骨肉瘤细胞MG-63和HOS，发现可明显抑制STK35 mRNA表达，且显著抑制骨肉瘤细胞增殖[14]。IRX2可对多种免疫系统细胞如树突状细胞(DC)、T细胞和自然杀伤性细胞起作用，从而克服肿瘤介导的免疫抑制作用[15]。史继德等[16]采用IRX2-siRNA转染骨肉瘤细胞MG-63，并用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪检测 MG-63 细胞增殖和周期，蛋白免疫印迹法检测JAK3和STAT5活化水平，结果发现沉默IRX2表达可显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖，促使其S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例降低，且IRX2-siRNA可下调JAK3和STAT5活化水平，而转染pcDNA3.1-IRX2可上调IRX2 mRNA及蛋白表达，且过表达IRX2可上调JAK3和STAT5水平；进一步采用JAK3和STAT5抑制剂处理MG-63细胞后发现，转染后的MG-63细胞增殖受抑制，且pcDNA3.1-IRX2诱导的细胞增殖部分受抑制，表明IRX2-siRNA可通过JAK3/STAT5信号转导通路作用于骨肉瘤细胞增殖。染色体盒蛋白同源物 3(CBX3)是异染色蛋白1的直系同源物之一，与基因转录抑制及沉默有关[17]。Ma等[18]研究发现，相比脂肪组织及正常骨细胞，人骨肉瘤细胞中CBX3过表达；为研究CBX3在骨肉瘤中的功能和预后价值，将CBX3-siRNA转染人骨肉瘤细胞MG-63，发现骨肉瘤细胞生长明显减少，通过流式细胞仪分析发现，抑制CBX3表达可诱导细胞周期停滞在G0/G1期，并促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡。由此表明，CBX3-siRNA可通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞来实现抑制骨肉瘤细胞增殖。此外，范兆阳等[19]将siRNA-PLK1转染人骨肉瘤细胞，发现转染后细胞中PLK基因表达水平下调，且可有效抑制骨肉瘤细胞增殖。因此，构建特异性siRNA下调或抑制骨肉瘤增殖相关基因表达，对骨肉瘤细胞增殖有明显的抑制作用。

1.3 促进骨肉瘤细胞凋亡

糖原磷酸化酶是细胞中糖原分解的关键酶，人类糖原磷酸化酶有3种同工型,分别为肝型、肌型、脑型(PYGB)[20]。先前的研究发现PYGB在非小细胞肺癌、胃癌等中过表达[21-22]。Zhang等[23]用PYGB siRNA 转染PYGB过表达的人骨肉瘤细胞 MG-63和 HOS，通过蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达，结果表明MG-63和HOS细胞中Bax明显上调，Bcl-2明显下调，诱导细胞凋亡，进而激活Bcl/Caspase 信号转导通路，证明PYGB干扰可能通过Bcl/Caspase 信号转导通路阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。此外，Shen等[24]将TCTP siRNA通过质粒转染人肾上皮细胞系(293细胞)，48 h后收获慢病毒颗粒(Lv-shTCTP和Lv-shCon)，分别感染Saos-2和U2OS细胞，流式细胞仪分析发现Lv-shTCTP 组中S期细胞百分比显著增加，而G2/M期细胞百分比随之降低；随后检测一些细胞周期调节因子和凋亡标记物表达水平，发现TCTP受抑制， G2/M 期相关蛋白 Cyclin B1 和 Cdc25A水平下调，但TCTP耗竭后，凋亡因子如 Bad 和 Caspase-3 断裂被逆向上调。这些结果证实，TCTP siRNA可通过抑制CyclinB1和Cdc25A阻止细胞周期进程，并通过诱导 Bad和Caspase-3促进细胞凋亡。研究表明，特殊细胞周期分裂蛋白20(CDC20)高表达与实体瘤中生存率不良相关[25]。Gao等[26]将CDC20 siRNA分别转染到骨肉瘤细胞MG-63和U2OS中，结果显示转染后细胞中CDC20蛋白水平明显降低，且骨肉瘤细胞凋亡加速，CDC20耗竭可诱导骨肉瘤细胞周期停滞在G2/M期，表明CDC20抑制增强了骨肉瘤细胞凋亡，并诱导细胞周期停滞。

1.4 调控骨肉瘤药物敏感性

随着化疗的不断进步，骨肉瘤患者5年生存率得到了极大提高，骨肉瘤一线化疗通常包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤联合治疗，但高剂量的化疗药物导致不良反应十分明显，所以进行增强骨肉瘤对化疗敏感性的研究十分必要。热休克蛋白(HSP)是一种伴侣蛋白，可通过一系列不同应激如热刺激等诱导，并起保护细胞免受应激作用。研究表明，HSP70与多种癌症预后及抗癌药耐药有关。Mori等[27]将HSP70 siRNA转染人骨肉瘤细胞MG-63，并将转染后的细胞用顺铂处理，48 h后发现与对照组相比，HSP70 siRNA 转染组HSP70 蛋白和mRNA表达均被明显抑制，且在Hsp70 siRNA转染细胞中顺铂半抑制浓度(IC50)值显著降低，证明抑制骨肉瘤细胞中HSP70表达可增强其对顺铂的敏感性，抑制HSP70 表达有可能为骨肉瘤化疗提供新的辅助治疗方法。

白细胞介素(IL)-22可能可调节骨肉瘤细胞生长。Li等[28]将IL-22 siRNA用质粒分别转染MG-63/DDP细胞及MG-63细胞，发现IL-22 siRNA可显著降低MG-63/DDP细胞活力并诱导细胞凋亡，IL-22 siRNA可下调Bcl-2和磷酸化STAT3蛋白表达，上调Bax表达，并切割Caspase-3，且显著降低顺铂IC50值；将IL-22过表达质粒转染MG-63细胞，结果显示过表达IL-22可显著增加MG-63细胞中顺铂IC50值，增加MG-63细胞活力，抑制细胞凋亡，上调Bcl-2和磷酸化STAT3表达，下调Bax和Caspase-3表达。这表明IL-22可通过调节STAT3信号转导通路影响骨肉瘤细胞活力和凋亡，从而影响骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。但未来仍需进一步研究确定IL-22表达水平与骨肉瘤细胞中顺铂IC50值之间的关系。

Copine1(CPNE1)是高度保守的钙依赖性磷脂结合蛋白，可能在调节信号转导和膜运输中起作用。Jiang等[29]将CPNE siRNA转染人骨肉瘤细胞后，用2种计量的顺铂和阿霉素分别处理转染后的MG-63细胞，结果显示CPEN1可减弱这两种药物对 Saos-2细胞增殖的抑制作用，为CPNE抑制剂与一线化疗药物联合治疗骨肉瘤提供了直接证据。

1.5 抑制骨肉瘤细胞侵袭能力

四跨膜蛋白是具有4个跨膜结构域的膜蛋白家族，人类中已知 33 种四跨膜蛋白，包括CD9、CD63、CD81、CD82和CD151等。Mizoshiri等[30]研究发现，CD81在骨肉瘤细胞，尤其是骨肉瘤细胞143B中高表达；应用基因工程技术构建3种siCD81，将其转染人骨肉瘤细胞MG-63/143B，发现3种siCD81分子在所有测试的细胞类型中均显著抑制 CD81 mRNA表达，并通过MTT比色法及伤口愈合实验发现被 siCD81 转染的细胞增殖受显著抑制，且48 h后迁移能力受显著抑制，证明siCD81对于骨肉瘤迁移具有明显的抑制作用。骨形态发生蛋白(BMP)是一种生物多肽生长因子，其可促进骨肉瘤细胞生长。Chen等[31]通过将BMP-2 siRNA转染人骨肉瘤细胞MG-63，发现骨肉瘤侵袭能力受到明显抑制。

2 siRNA应用存在的问题

siRNA临床应用中主要存在的难题是开发将 siRNA传递至靶细胞安全有效的方法，以及如何对靶组织施用具有生物活性的siRNA。目前siRNA递送主要有局部递送和全身递送2个有效途径，已研究出如基于脂质的纳米颗粒(LNP)、N-乙酰半乳糖胺共轭siRNA系统(GalNAc-siRNA)和靶向 RNA干扰分子(TRiM)平台等多种递送系统来克服siRNA传递障碍。但siRNA传递中仍存在许多挑战，siRNA 具有很高的特异性，可以实现所需的靶标沉默，但它们可能会产生诸如多种类型脱靶效应、由于脱靶效应造成的siRNA 长期安全性隐患、siRNA 免疫原性、纳米载体长期安全性、全身性 siRNA 传递中的非特异性肝脏吸收及由于疾病异质性造成的单个siRNA沉默1种特定致癌基因可能不足以有效地引起长期肿瘤抑制等问题[32]，尚需进一步研究。

3 展望

自RNA干扰发现以来，学者们对基因沉默治疗某些疾病表现出了极大的兴趣与期望，在了解和利用基因沉默技术方面已取得显著进展。骨肉瘤是骨科中最常见的原发性恶性肿瘤，siRNA不仅有望为骨肉瘤提供一种全新的革命性治疗方法，而且有降低骨肉瘤耐药性的可能，且与传统化疗相比，siRNA治疗不良反应极小。上述研究证明，通过siRNA诱导基因沉默可对骨肉瘤发生发展调控，且对骨肉瘤治疗有巨大的应用前景，但目前尚无一种安全、高效的治疗方法投入临床中。如何设计一种安全、稳定、可携带多种siRNA及化疗药物或其他治疗剂的递送系统，是减少化疗药物剂量、降低不良反应的关键，需进一步探索研究。