拉曼光谱技术在骨科疾病中的应用研究进展

连天星 刘罡 李林涛 尹愚 常山 屈波 杨子萱

随着世界人口结构改变，老龄化人口越来越多，骨关节炎(OA)、骨质疏松(OP)、关节退行性变等与年龄密切相关的骨科疾病发病率也逐年上升[1]。到2050年，全球髋部骨折的患者可能达到450万人，而髋部骨折多发生于老年骨质疏松患者，其高致残、致死率已成为临床面临的一大难题[2]。

目前骨科疾病的诊断方法依赖于X线、CT检查及病理活检，当上述疾病出现阳性检查结果时，已有明显的器质性损害。鉴于疾病进展过程中代谢异常比形态改变出现更早，快速获取准确且全面的代谢物质信息是目前诊断或筛查方法改进和创新的方向，其可以满足早发现、早诊断、早治疗的预防目标。

拉曼光谱检测是一种高灵敏度、非破坏性的光学探测技术，当激光照射在样本上时，样本中的分子被激发出现更高的振动或转动能级，并产生拉曼散射，该技术记录了此样本全部生化信息如蛋白质、核酸及脂类等[3]。由于只需少量样本、耗时短、精度高、不需要标记且不会破坏样本原有性质，拉曼光谱技术已成为多个领域的重要研究技术[4-5]。

1 拉曼光谱技术简介

当光束与分子相互作用时，能量大多以与入射光相同的频率进行弹性散射，称为瑞利散射。少数入射光激发分子振动发生能量交换而出现非弹性散射，这种现象在1928年被印度科学家Raman发现，现称为拉曼散射。其中波长增加的光称为斯托克斯光，波长减少的光称为反斯托克斯光。入射前后的光子能量差异对应于激发特定分子振动所需的能量，不同的波段对应不同官能团的振动频率，因此每个分子都有独特的光谱，称之为“指纹”[6]。根据拉曼散射原理，现已有超过25种不同类型的拉曼光谱技术应运而生，目前常用拉曼光谱包括受激拉曼光谱、相干反斯托克斯拉曼光谱、表面增强拉曼光谱和尖端增强拉曼光谱等。

由于拉曼光谱技术可对分子大小的物质进行探测，该技术具有监测细胞代谢过程中物质改变、快速定量检测样本中关键物质的潜力，并可实时反映疾病动态演变和治疗效果。

2 拉曼光谱技术在骨科疾病中的应用

由于拉曼光谱技术具有快速、准确、样本需要量小等特点，目前学者们应用该技术研究引起骨科疾病的各种代谢物质，并探讨以此进行疾病早期筛查或诊断的可能性。学者们对细胞[7-8]、血液[9]、尿液[10-11]、关节液[12-14]、韧带[15]、指甲[16-17]和骨组织[18-19]进行大量研究，发现各种疾病具有特有的代谢改变，因此光谱检测数据结合多种优秀算法建立诊断模型能快速实现疾病筛查、诊断和分期。

2.1 关节疾病

OA是一种关节软骨退行性变及继发性骨质增生的慢性关节疾病，好发于老年患者大关节。在60岁以上的老年人中，男性患病率约10%，女性患病率约18%[20]。目前OA诊断依赖于X线检查，CT和MRI检查常用于鉴别诊断，而实验室检查指标一般在正常范围内[21]。当影像学表现满足诊断标准时，患者已有明显的器质性改变[22]，因此探索出能尽早发现疾病初期病理变化的检查方法是临床急需解决的问题。

关节滑液是关节软骨代谢、物质交换场所，对关节滑液进行拉曼光谱检测有助于发现OA早期代谢改变。朱永康等[12]构建早期OA犬模型，抽取关节液进行拉曼光谱检测，早期OA组光谱在901 cm-1(透明质酸)、944 cm-1(透明质酸/糖胺聚糖)、1 070 cm-1(硫酸多糖)、1 126 cm-1(吡喃糖环/透明质酸)等多糖谱带处信号强度比健康组明显增强，提示多糖成分在OA早期就出现变化，软骨内部代谢异常早于结构改变。Bocsa等[13]将OA患者分为低度和高度损伤，对关节滑液进行拉曼光谱检测，自发拉曼光谱检测和表面增强拉曼光谱检测分别显示两组胡萝卜素和苯丙氨酸出现差异，拉曼光谱检测结合主成分分析(PCA)-线性判别分析(LDA)对两类人群进行分类，准确率达到100%，证明拉曼光谱检测可以捕捉到OA患者关节滑液中的物质变化。拉曼光谱检测对滑膜型关节炎同样有较高的诊断准确率。董弦虎等[14]对滑膜型关节炎患者和健康人关节液进行实验，表面增强拉曼光谱检测显示，滑膜型关节炎患者关节液中多糖、DNA、鸟嘌呤等高于健康人，而糖原、磷脂酰肌醇、蛋白酪氨酸、葡萄糖等低于健康人，表面增强拉曼光谱检测结合PCA-LDA的诊断灵敏度为80%，特异度为83.3%，显示了该技术快速、高效检测和区分关节炎患者的能力。

拉曼光谱检测时间短，小型拉曼光谱仪只有鞋盒大小，很容易在常规诊室中使用，因此临床上有可能在标准的接诊时间内获得患者关节液的成分信息，从而快速诊断骨与关节疾病。

2.2 OP

OP是骨科常见疾病，我国流行病学显示50岁以上女性约20.7%患有OP，男性约14.4%患有OP，60岁以上患病率显著升高[23]。OP与年龄密切相关[24]，所以必须加强对危险人群的早期筛查与识别。双能X线吸收仪(DXA)是目前诊断OP的金标准，但由于其具有设备成本高、属于辐射性检查、检测费用昂贵等问题，很难成为普惠性的筛查技术，所以寻找方便快捷、无辐射且基于OP早期代谢改变的筛查方法备受关注。

脆性骨折是OP的严重并发症，骨骼抗骨折能力并不完全取决于骨密度，矿化程度、胶原组织、皮质孔隙度等同样会影响骨骼断裂韧性。Paolillo等[18]对去卵巢OP大鼠股骨进行拉曼光谱检测，发现OP组碳酸盐/磷酸盐值在长期绝经后显著增加。Ishimaru等[19]对切断坐骨神经的废用性OP小鼠胫骨进行实验，发现OP组碳酸盐/磷酸盐值较高，矿物/基质值也明显高于对照组。矿化水平过度增加，骨骼硬度增加，可能提高脆性，导致骨折风险增加，拉曼光谱检测可全面阐明骨组织中矿物质和基质成分变化，是一种有前景的OP筛查工具。但临床上对OP患者骨组织进行拉曼光谱检测较为困难，所以寻找能替代骨组织的样本，从而研究微创或无创的拉曼光谱检测方法是未来的发展方向。

由于OP是一种全身性骨代谢异常疾病，指甲成分可能可为了解骨骼的健康状况提供有价值的信息。Beattie等[16]对OP患者指甲进行拉曼光谱检测，发现OP组指甲中角蛋白的二级结构β-折叠比例升高，且有较多酸性基团被电离，这些基团对于形成骨矿物质和骨胶原支架至关重要。人类指甲和骨骼中的蛋白质需要硫酸化和二硫键形成来保证结构的完整性。Towler等[17]研究发现，OP性骨折患者指甲二硫化物含量低于健康人，提示指甲中的二硫化物可作为骨组织中相关结构基质蛋白的替代标记物。然而，不同个体的指甲物理化学性质和生长速度差异较大，限制了通过指甲测量骨矿含量及评估骨骼健康的应用[25]。

骨代谢标志物存在于血液中，部分通过尿液排出，对尿液进行检测，一定程度上可以反应骨代谢是否正常。有研究对OP患者尿液进行拉曼光谱研究，发现在绝经后妇女中骨量异常组与骨量正常组在723 cm-1、786 cm-1、1 000 cm-1处信号强度有统计学差异，拉曼光谱检测结合PCA-LDA分析诊断OP总体准确度为79.3%，诊断骨量减少总体准确度为78.2%[11]。研究发现，在2型糖尿病患者中，骨量异常组与骨量正常组在1 377 cm-1、1 525 cm-1处拉曼光谱强度存在显著性差异，此处代表物质为脂质和蛋白质，这与血液中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白升高相一致，认为拉曼光谱检测诊断骨量异常的灵敏度为65.5%，特异度为90%[10]。

拉曼光谱检测是评估OP患者骨质量和预测骨折风险的重要分析工具，且能提供丰富的关于骨材料特性和结构的独特信息，可以对OP患者各种组织成分和结构变化进行分析，有助于进一步了解发病机制，评估骨折风险，并对骨量异常患者进行初步筛查。由于OP是一种骨代谢疾病，大部分代谢物质经过血液循环，其中Ⅰ型前胶原氨基端前肽和β-胶原降解产物是国际骨质疏松基金会推荐评估骨转换水平的参考指标，若后续研究能针对患者血液样本进行拉曼光谱检测，发现更多与OP相关的代谢物质，OP诊断或筛查准确率将得到进一步提高，从而使拉曼光谱检测有望成为OP新的筛查手段。

2.3 骨肿瘤

骨转移是恶性肿瘤最常见的并发症之一，乳腺癌和前列腺癌骨转移发病率在65%以上[26]。肿瘤转移是癌症患者生活质量下降的主要原因，且目前监测肿瘤早期发生骨转移的能力有限。由于拉曼光谱检测实时、精确的分子特性，它具备评估和量化早期发生骨转移所引起的生化改变的能力。

乳腺癌通常会转移至骨，并破坏骨微环境的稳态，从而引起溶骨改变。Zhang等[27]对乳腺癌骨转移小鼠与正常小鼠的股骨和椎体进行拉曼光谱分析，结果显示骨转移组碳酸盐取代、整体矿化及结晶度都呈增加趋势，拉曼光谱检测结合支持向量机开发算法诊断股骨肿瘤转移准确率达到93.6%。这证明拉曼光谱检测能识别肿瘤早期转移部位和矿物变化，这种变化可能在骨骼形态改变之前就已存在，但目前尚缺乏完全无创的拉曼光谱检测评估方法是限制其临床应用的主要问题。除了在骨组织中能检测到肿瘤引起的矿物改变外，在不同的肿瘤细胞中也存在结构差异。Marro等[8]对倾向于骨转移的MDA-MB231和倾向于肺转移的MDA-MB435乳腺癌细胞进行拉曼光谱分析，发现氨基酸水平升高和线粒体水平降低是骨转移细胞的特征，而肺转移的细胞则以高脂质和高线粒体水平为特征。

骨是前列腺癌通过血液途径进行远处转移的最常见部位。Shao等[9]收集前列腺癌伴骨转移和不伴骨转移患者的血清并进行表面增强拉曼光谱检测，发现卷积神经网络结合表面增强拉曼光谱检测筛查骨转移患者准确率为81.70%。表面增强拉曼光谱检测血清可对前列腺癌、前列腺增生患者和健康人进行分类[28]，证明拉曼光谱检测可能成为补充实验室诊断并监测前列腺癌骨转移的有效手段。

骨肉瘤是一种最常见的原发性恶性骨肿瘤，全世界每年发病率约1～3/100万，发生转移或复发的患者5年生存率约20%[29]。骨肉瘤分级依赖于传统的组织病理学，既耗时又需要一定数量的肿瘤标本，如何在术中快速、准确地判断肿瘤恶性程度是亟待解决的问题。Chiang等[7]对高级别骨肉瘤细胞143B、SaOS2和低级别骨肉瘤细胞MG-63进行拉曼光谱检测，不同恶性程度的细胞在960 cm-1(羟基磷灰石)处光谱强度有显著性差异，提示羟基磷灰石水平与骨肉瘤预后相关。拉曼光谱检测是区分不同级别肿瘤细胞的潜在精确且灵敏的方法，有助于骨肉瘤或其他病理组织快速诊断。

2.4 韧带疾病

韧带在限制各个关节过度活动、维持全身骨骼稳定等方面起着至关重要的作用。前交叉韧带(ACL)位于膝关节内，可限制胫骨过度前移，维持膝关节稳定。ACL损伤将会导致膝关节不稳，甚至OA发生[30]。目前诊断韧带损伤主要依赖于MRI检查，但该方法只能识别较为明显的韧带断裂或黏液样变性，观察微观结构成分仍需要组织病理学分析。Matsunaga等[15]收集退变的ACL样本进行拉曼光谱检测，认为拉曼光谱检测能清楚识别退变早期和晚期细胞、胶原、磷脂等物质的差异，结合基于LDA建立的算法，对两者分类准确率达到了91%，该技术使保留韧带前提下研究其成分改变并诊断退变程度成为可能。

3 结语

目前对骨科众多疾病的早期筛查或诊断技术的研究尚处于初级阶段，在开展早发现、早诊断、早治疗的实践过程中，应结合现有的先进科学技术，基于疾病发病机制进行研究。由于拉曼光谱技术对物质组成和结构的研究展现出独特的优势，有望在形态学还没发生改变之前找到疾病在分子水平上的特征性改变。拉曼光谱检测作为一种新技术可补充现有医学上的不足，为医学与工程技术结合提供广阔的舞台。考虑到临床实际应用，对拉曼光谱检测还应进行更多的临床试验，开发更为先进的无损检测技术，建立并优化诊断模型，使之成为标准的临床检测技术。