四面体DNA纳米材料在骨组织工程中的应用

何易祥 赵宇昊 高昭 张通 赵海燕 王文己

骨骼系统参与了人体内诸多生理活动的调控，在维持人体内环境稳态过程中发挥关键作用，包括保护及支持其他器官、储存和调节矿物质、调节血液pH值等，其内容纳了造血干细胞及多种生长因子[1]。由严重外伤、骨骼畸形矫正、骨肿瘤切除等导致的骨结构破坏需采取有效措施进行治疗，避免发生不愈合，影响人体功能[2]。目前临床上广泛采用的自体或异体骨移植方法尚存在诸多问题[3]，因此需探究是否有更有效的治疗措施。基于组织工程研制的生物材料可为人体提供具有良好性能、有助于修复受损骨组织、对人体无毒性作用的人工骨材料，在骨缺损修复中发挥重要作用。近年来随着基因水平研究的不断进展，基于DNA分子特点研究有合适结构且具有生物活性的生物材料逐渐成为骨组织工程研究的热点。

1 DNA纳米材料及骨修复

随着基因研究的不断进展，基因治疗技术被发现可用于治疗多种疾病。基因治疗需由载体介导进入细胞后发挥作用，以DNA分子为基础的DNA纳米技术随之得到发展。Seeman[4]报道，核苷酸序列将优先形成固定的连接而不是线性双链，从而提出“结构纳米技术”概念。随后他们首次自组装合成了具有双螺旋结构边的三维立方体DNA纳米结构[5]。此后多种形态的DNA立体结构被相继合成[6-12]。

DNA纳米结构的可编辑性及生物相容性等特点使其成为基因治疗技术的热点[13]。DNA分子在适宜的条件下，凭借独特的双螺旋结构及高度特异性的碱基互补配对原则可进行自组装，将设计好的单链DNA组装成多种形态的DNA纳米结构。它具有独特的优点：①相较于DNA大分子，易穿透带负电的细胞膜进入胞内[14]；②由于以人体固有的DNA为原料，几乎无细胞毒性作用[15]；③有丰富的修饰位点，可携载多种生物分子进入细胞[16]。

随着基于纳米技术的生物材料被开发，基因疗法被广泛应用。基因疗法与骨组织工程相结合，即将成骨相关基因载入生物材料中形成复合体，随后介导入胞发挥作用，从而在基因水平上刺激骨组织修复过程。Bara等[17]将强力霉素诱导的Tet-on腺病毒载体与骨髓基质细胞(MSC)、纤维蛋白及双相磷酸钙陶瓷(MBCP)相结合用于修复裸鼠骨缺损，体内研究临界尺寸的股骨缺损中腺病毒BMP-2基因递送对骨骼愈合的影响，通过调节强力霉素浓度调控BMP-2的表达，结果显示实验组缺损部位新骨形成明显多于对照组，且不同的载体递送方法(直接应用与预包被MBCP颗粒)均可达到治疗效果，强力霉素诱导的BMP-2表达通过软骨内骨化作用启动骨愈合过程。此外，Li等[18]使用掺入BMP-2质粒DNA的壳聚糖纳米颗粒修复大鼠和比格犬骨缺损。Pan等[19]使用金纳米颗粒作为载体研究miR-29b调节成骨作用的特性，结果显示它在人体内几乎无细胞毒性，且可诱导成骨基因如RUNX2、OPN、OCN、ALP等的长期表达，促进成骨细胞分化和矿化。以上研究均显示了生物材料介导的基因疗法在骨组织修复中的有效性。

2 四面体DNA纳米结构组成

四面体DNA纳米结构(TDN)材料是一种通过DNA折纸技术形成的具有四面体结构的DNA纳米材料。2004年，Goodman等[8]首次设计合成TDN，其具有良好的机械强度和结构稳定性，且易于合成。

TDN合成是由4条预先设计相互配对的单链DNA等量加入缓冲液中，通过碱基互补配对原则，经成熟的退火法操作，两两间相互配对折叠形成四面体。每条单链DNA的碱基分为3个小片段，各片段间使用不配对的碱基相隔，以保证顶点具有柔韧性，每条单链的1个小片段与另1条单链的1个小片段互补配对，形成四面体的1条边。每条单链DNA的5′-端和3′-端交汇于四面体顶点或在边上形成1个端口，交汇于顶点时，可在单链的5′-端或3′-端连接功能分子，实现其功能化；交汇于端口时，可添加功能分子修饰或使用DNA连接酶封闭端口。合成后的TDN可由聚丙烯酰胺凝胶电泳、原子力显微镜及动态光散射技术等进行表征。

而Li等[20]使用1条含有286个核苷酸的单链DNA成功设计合成了TDN。该组装过程简化，易于扩增，且具有较好的抵抗酶解特性，为合成TDN提供了新方法。

与其他DNA结构相比，TDN能利用特殊的三维结构，在有或没有转染剂的辅助下，均可有效进入哺乳动物细胞内[14]，它通过小窝蛋白的内吞作用进入细胞[21]，避免了原始DNA分子在没有辅助剂的情况下难以大量进入细胞的缺陷。

使用TDN进行治疗时，它需进入体内并在体内环境中维持稳定性，避免被过度降解消除。研究表明，二价离子可有助于平衡DNA螺旋结构间的静电排斥作用，因此在缓冲液中加入Mg2+可保持DNA纳米结构的完整性[22]。Mg2+浓度过高可使其过度聚集，过低则影响TDN合成，因此需进一步探究适宜的Mg2+浓度。

3 TDN应用

TDN已被证实有重要的功能，可通过DNA纳米材料传导生物活性分子如miRNA、siRNA、药物等入胞发挥作用，且可调节细胞功能，从而进细胞增殖。

3.1 药物运输

TDN结构中的黏性末端可作为其他物质的结合位点用以构建TDN复合物，介导功能性分子进入细胞内，从而发挥生物学功能。TDN由于能渗透入细胞膜且具有生物相容性和可降解性，因此可作为药物运输载体，在修饰位点结合不同官能团后可改变其药物输送能力。Li等[23]将抗癌适配体AS1411连接到TDN末端，组成Apt-TDN后，比较低氧状态下Apt-TDN与TDN在肿瘤细胞和正常细胞中的定位及对细胞生长的影响，发现Apt-TDN对肿瘤细胞有更好的靶向性，并能高效进入肿瘤细胞内发挥生理作用，证实结合抗癌适配体AS1411可提高TDN的药物输送能力。Kim等[24]将TDN与阿霉素进行结合，发现其更易递送到靶细胞，可显著抑制多重耐药性(MDR)细胞生长。有研究将阿霉素插入经过修饰的KLA-TDN后，KLA-TDN-阿霉素复合体靶向传递至线粒体，启动了线粒体介导的程序性细胞凋亡途径[25]。以上研究表明，结合不同的适配体可能发挥不同的作用或影响生物材料生理功能。

目前有研究将TDN作为基因载体与其他物质结合。Lee等[26]将siRNA通过与TDN结合传递到细胞内，进而靶向抑制肿瘤基因表达，该复合物在体内有较长的半衰期，有助于分子发挥作用。Meng等[27]为增加DNA核酶被细胞摄取的能力，使用TDN作为载体，将Dz13序列直接添加到单链DNA的5′-末端，形成四面体结构，进而将其介导入胞，结果显示其具有高效的细胞摄取效率，且不影响Dz13活性，可靶向裂解c-Jun的mRNA，从而抑制鳞状细胞癌生长。

3.2 生物分子检测

携载分子的三维DNA结构也可用于检测其他生物大分子。Hu等[28]将TDN结合到链霉亲和素涂层的量子点(QD)，获得了QD-Cy3-Texas Red-Cy5四面体DNA，并证实该物质不仅可在复杂的生物样品中同时均质检测多种核酸酶如HaeⅢ、EcoRV和Pvull等，而且可用于进行多种酶抑制剂的筛选。Li等[29]将设计合成的TDN共价偶联到玻璃表面，其显示出良好的生物识别能力，可高度敏感和选择性地检测不同类型的生物活性分子如蛋白质、miRNA等，且较为高效，应用前景广阔。

3.3 组织血管形成

实现组织血管化是进行受损组织修复的重要部分。新生血管能将营养物质输送到代谢活跃的组织内，促进愈合，因此对骨修复具有重要作用[30]。血管生成是血管内皮细胞迁移和增殖形成具有血管网络系统的过程，体内植入假体后，周围组织炎性反应将有助于诱导血管发生，但此过程速度较慢，不利于组织修复过程，而TDN可在此过程中增强血管生成作用。Zhao等[31]培养小鼠内皮细胞，使其暴露于250 nmol/L浓度的TDN中，发现TDN可进入内皮细胞且促进内皮细胞增殖和迁移，同时检测到血管生成相关生长因子表达上调，并伴有Notch信号转导通路激活。

在糖尿病患者中，为防止致残及降低截肢风险，对伴发的糖尿病伤口预防十分必要，伤口愈合过程中的血管化对于伤口恢复不可或缺。Lin等[32]研究发现，TDN可以保护内皮细胞功能，减轻炎症，并经Akt/Nrf2/血红素加氧酶-1(HO-1)信号转导通路通过其抗氧化活性抵抗氧化损伤。

3.4 干细胞功能调节

对干细胞分化及功能进行调节是骨组织工程研究的重点，TDN对于干细胞迁移及功能表达具有明显作用。研究证实，TDN在脂肪来源干细胞、牙髓干细胞、神经干细胞等中具有促进细胞增殖、迁移及成骨分化的作用[33-37]。脂肪来源干细胞是一种由脂肪组织中分离得到的具有多向分化潜能的干细胞，主要参与促进组织细胞再生、加快组织细胞修复等。脂肪来源干细胞具有向成骨样细胞分化的能力，与骨髓来源干细胞相比，其来源丰富，易于获取且对患者损伤程度小，被视为理想的骨再生干细胞[38]。但单独的脂肪来源干细胞没有足够的成骨能力，不能修复较大骨缺损，因此需与其他生物材料相结合以增强其成骨能力。Shi等[39]研究TDN对大鼠脂肪来源干细胞迁移的影响，发现TDN可显著增强大鼠脂肪来源干细胞迁移，并下调长非编码RNA(lncRNA)XLOC 010623，从而激活Tiam1和Rac1的mRNA表达。此外，TDN可上调RHOA、ROCK2和VCL的mRNA和蛋白表达，进而证实TDN通过抑制lncRNA XLOC 010623转录并激活Tiam1/Rac1和RhoA/ROCK2信号转导通路基因表达，促进细胞迁移，且TDN促进脂肪来源干细胞迁移的作用呈浓度依赖性。Shao等[40]将脂肪来源干细胞暴露于TDN，发现其增殖和成骨分化作用增强，免疫荧光测定显示有β-catenin表达，Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因和蛋白表达上调，且暴露24 h后出现更强的荧光信号，表明TDN在脂肪来源干细胞分化增殖过程中具有重要作用，且经典的Wnt/β-catenin信号转导通路可能是其发挥作用的重要机制，为基于脂肪来源干细胞骨缺损修复提供了新方向。

3.5 骨与软骨细胞修复

骨关节炎是一种常见的退行性关节软骨病变，其病理过程伴随着大量的软骨细胞凋亡。因此，骨关节炎治疗过程中应关注软骨细胞功能的修复。软骨细胞凋亡和骨关节炎发生与细胞自噬减少有关。TDN对细胞自噬有促进作用。Shi等[41]研究发现，软骨细胞暴露于TDN后，在没有辅助剂的情况下，TDN可以顺利进入软骨细胞，且主要集中在软骨细胞细胞质内。随后，Shi等[42]成功合成TDN并使其进入经白细胞介素(IL)-1β诱导的软骨细胞内，发现TDN通过激活BCL2/BAX/caspase-3信号转导通路来减少软骨细胞凋亡，通过激活Nrf2/HO-1信号转导通路来抑制IL-1β诱导的氧化应激，通过上调LC3-Ⅱ、Beclin1和Atg7增强自噬。此外，TDN还可通过调节Wnt/β-catenin信号转导通路发挥软化作用。以上研究表明，TDN作为生物材料可防止骨关节炎进展，对骨关节炎有潜在的治疗价值。

在骨组织工程研究中，利用生物材料对软骨细胞表型及增殖过程进行调节是一种有效的方法，以此可将软骨细胞引向所需的位置，从而发挥功能。TDN可能会对软骨细胞产生生物效应，并促进软骨细胞向损伤部位运动。Shi等[43]采用退火法合成TDN，使用实时细胞分析和伤口愈合实验研究TDN对从大鼠关节软骨分离的软骨细胞运动的影响，使用定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法和免疫荧光检测相关基因及蛋白变化，证实TDN可增强软骨细胞活动能力，且RhoA、ROCK2和vinculin的mRNA和蛋白表达增强，这种作用在TDN浓度为250 nmol/L时最为显著，表明TDN结构可能有助于软骨修复过程，且与浓度相关。Shao等[44]使分离得到的小鼠软骨细胞暴露于制成的TDN中，发现TDN能调节软骨细胞表型，促进软骨细胞增殖，同时出现与Notch信号转导通路相关基因和蛋白低表达及Ⅱ型胶原高表达。这些结果表明，TDN可能是软骨增殖及功能调节的重要物质，可能可用于软骨修复。

4 结语

已有诸多研究逐渐证实了TDN功能及其在骨组织分化过程中的作用，为解决临床问题提供了新思路。但目前尚有诸多问题未能完全解决，如对骨髓来源的造血干细胞是否有积极作用及其机制如何、其结合位点是否能携带与成骨有关的因子、如何保持其在体内的生物活性、能否对肌肉组织产生作用等，仍需进行进一步研究。