芒萁黄酮类物质成分鉴定及体外抗氧化活性研究

欧阳可凡，王文君

(1.南昌大学食品学院，江西 南昌 330031；2.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045)

芒萁(Dicranopterispedata)，真蕨目里白科芒萁属植物，是亚热带红壤丘陵区次生植被的标志种和识别种，广泛分布于中国长江以南各省及东南亚地区[1-2]。因其耐旱耐瘠耐酸、繁殖生长能力极强，在保护南方红壤侵蚀区水土流失起着重要作用[3-4]。由于芒萁茎叶刚韧且粗糙，不易消化吸收，适口性较差[5]，通常不做饲草用，而被视做生态草、观赏草、能源草，同时也可做为工业草提取天然色素或做为药用草。据记载，芒萁可全株入药，有泻火利尿、止血化瘀的功效[6]。芒萁含黄酮、皂苷及多糖类等活性成分，具有很强的抗氧化、抗菌、抗癌活性，对帕金森病也有一定的疗效[7-10]。黄酮是一种植物次生级代谢产物，在人体中无法合成，仅可通过食物摄入。因其优异的抗氧化活性，能够起到预防心脑血管疾病、抗癌等作用[11]。经测定芒萁中黄酮的含量高达13%以上[7]，比红豆草和小冠花等豆科牧草的黄酮含量(0.46%～1.70%)[12]要高得多。目前，芒萁在我国虽然分布极广，产量也极为巨大，但芒萁黄酮的保健功效和药理作用并未受到人们的关注。本研究采用超声波法辅助法提取芒萁黄酮，分析其总黄酮的含量，并对其成分进行鉴定，进而探讨了其体外抗氧化活性，以期为进一步开发利用芒萁这一南方地区常见药用草提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试芒萁于2020年7月采摘于江西省赣州市宁都县翠微峰国家森林公园。芦丁标准品、异槲皮苷标准品、木犀草素-5-O-葡萄糖苷标准品、阿福豆苷标准品：分析纯，北京Solarbio科技有限公司；聚酰胺树脂：30-60目，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇：色谱纯，TEDIA USA；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：纯度≥97%，东京化成工业株式会社；2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、盐酸、过氧化氢、硫酸亚铁、硝酸铝、水杨酸、亚硝酸钠、氢氧化钠、维生素C、无水乙醇、过硫酸钾等：分析纯。

1.2 试验仪器

粉碎机：XM-800Y型，永康市鑫之鸿电器有限公司；数控超声波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司；酶标仪：M2型，美国Molecular Device公司；有机相微孔滤膜：0.22 μm，Millipore USA；冷冻干燥机：Scientz-10N，宁波新芝生物科技股份有限公司；液相色谱仪：Agilent 1260 Infinity，Agilent USA；数显恒温搅拌循环水箱：HH-60型，国华仪器制造有限公司；电子天平：AUY220型，日本京都岛津制作所；循环真空水泵：SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市子华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪：N-1100型、油浴锅：OSB-2100型，上海爱朗仪器有限公司；低速离心机：TD4型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 芒萁黄酮的提取与纯化

1.3.1 芒萁黄酮粗提物制备 取其地上部位茎叶，剪碎并于60℃干燥后进行粉碎，过60目筛后密封保存。芒萁黄酮粗提物采用超声波辅助提取法提取[7]，取芒萁茎叶粉末5.0 g、与50%乙醇500 mL加入锥形瓶中混合，超声处理20 min，温度50℃，功率125 W；采用85℃恒温水浴90 min，4 000 r/min离心10 min后过滤，于60℃下进行真空减压浓缩至原体积的30%；冷冻干燥后保存备用。

1.3.2 芒萁黄酮的分离纯化 采用乙醇梯度洗脱法，根据文献[13]略作修改：活化聚酰胺树脂后，取适量芒萁粗提物，用蒸馏水配制成浓度25 mg/mL的试样液，缓慢添加进层析柱上端，吸附时间为2 h。采用4个浓度梯度(0%、30%、50%、70%)的乙醇溶液进行梯度洗脱，流速为1.5 mL/min，洗脱至解吸液无明显颜色即换用更高浓度。收集各梯度醇洗液，于60℃减压浓缩后冷冻干燥，最终得到水洗物、30%、50%、70%醇洗物。

1.3.3 芦丁标准曲线制作 称量芦丁标准品10.0 mg，用50%乙醇配制成0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL的标准液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，于510 nm波长下测定其吸光度(A值)，并制作标准曲线。采取最小二乘法进行线性回归，得到回归方程：Y=0.380 82A+0.019 67，R2=0.999 87，线性范围为0～0.02 mg/mL(图1)。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.4 芒萁黄酮含量的测定 分别取2 mg上述芒萁黄酮粗提物及不同梯度乙醇洗脱物，以50%乙醇溶解后定容至10 mL容量瓶中，按1.3.3的方法测定其黄酮浓度，并计算总黄酮含量。

式中：W为总黄酮百分含量，%；C为总黄酮浓度，mg/mL；M为样品质量，mg。

1.4 芒萁黄酮成分分析

采取HPLC法进行分析。分别取适量的芒萁黄酮粗提物和各浓度梯度醇洗物经甲醇溶解、有机滤膜(0.22 μm)过滤后采用C18色谱柱(4.6 mm×250mm，5 μm)，以乙腈(α)- 0.4%乙酸超纯水(β)系统为流动相，梯度洗脱(0～15 min，10%～25% α；15～30 min，25%～40% α；30～40 min，40%～50% α)，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，波长254 nm，柱温40℃。

将粗提物HPLC图谱各峰的峰面积数据代入标准品标准曲线，得到单体组分浓度，并计算黄酮单体组分百分含量。

式中：W为单体组分百分含量，%；C0为粗提物浓度，μg/mL；C1为单体组分浓度，μg/mL。

1.5 芒萁黄酮体外抗氧化试验

1.5.1 芒萁黄酮清除羟基自由基(·OH)能力试验 根据文献[14]修改如下：于10 mL离心管中加入2 mL FeSO4(6 mmol/L)，2 mL试样，2 mL过氧化氢(6 mmol/L)，2 mL水杨酸-乙醇(6 mmol/L)，恒温水浴处理20 min (37℃)，以蒸馏水为参考，于510 nm处测定吸光度。试样为不同浓度的(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)芒萁纯化黄酮溶液或Vc溶液。重复3次。

采用以下公式计算·OH清除率。

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为加入供试品的吸光度，A2为不加入水杨酸-乙醇溶液的吸光度。

1.5.2 芒萁黄酮清除ABTS+能力试验 参考文献[15-16]的方法：称取ABTS粉末5.0 mg于离心管，按照文献[17]配制成ABTS+工作液。于4 mL离心管中按顺序添加1 mL 80%乙醇，1 mL ABTS+工作液，摇匀，避光静置30 min，于734 nm下测定吸光值A0。于4 mL离心管中按顺序添加0.25 mL不同浓度(20、40、60、100、200、400 μg /mL)的芒萁纯化黄酮溶液或Vc溶液，0.75 mL 80%乙醇，1 mL ABTS+工作液，摇匀，避光静置30 min，于734 nm下测定吸光值A1。重复3次。

采用以下公式计算ABTS+清除率。

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为加入供试品的吸光度。

1.5.3 芒萁黄酮清除DPPH自由基能力试验 参考文献[14]的方法：于4 mL离心管中按顺序添加2 mL的DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)，2 mL浓度递增的芒萁纯化黄酮溶液(10、15、20、30、40、60 μg/mL)，避光反应0.5 h，以70%乙醇为参考，于517 nm测定其吸光度。试样为不同浓度的(10、15、20、30、40、60 μg/mL)芒萁纯化黄酮溶液或Vc溶液。重复3次。

采用以下公式计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为加入供试品的吸光度，A2为不加入DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.5.4 统计分析 采用Origin 2019软件绘图，采用SPSS 21.0进行t检验分析并计算其半抑制浓度IC50值。

2 结果与分析

2.1 芒萁黄酮提取率及芒萁黄酮纯化物的黄酮含量

本试验通过超声波辅助提取法得到了芒萁黄酮粗提物(CEE)，黄酮提取率为13.42%。采用乙醇梯度洗脱法对芒萁黄酮粗提物进行分离纯化，分别获得了水洗物(WE)、30%醇洗物(30%EE)、50%醇洗物(50%EE)、70%醇洗物(70%EE)。粗提物和不同梯度洗脱物黄酮含量测定结果见图2。以50%EE的黄酮含量最高，可达76.25%，其次为30%EE、CEE、WE，70%EE的黄酮含量最低，仅为2.37%。

图2 芒萁黄酮粗提物和不同梯度乙醇洗脱物的总黄酮含量Fig.2 Total flavonoid content of CEE and different ethanol eluates注：CEE：粗提物；WE：水洗物；30%EE：30%醇洗物；50%EE：50%醇洗物；70% EE：70%醇洗物

2.2 芒萁黄酮HPLC图谱及分析

芒萁黄酮粗提物和各醇洗物的HPLC图谱见图3。除70%EE组分的HPLC图无明显峰外，无论是粗提物还是各洗脱物的各峰分离效果都较好，杂峰较少，其纯化前后图谱各峰出峰时间并无明显差异。芒萁黄酮3个明显峰分别对应混合对照品中的异槲皮苷标准品、木犀草素-5-O-葡萄糖苷标准品、阿福豆苷标准品。

图3 芒萁黄酮HPLC图Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoids from Dicranopteris pedata注：A：CEE(粗提物)；B：WE(水洗物)；C：30%EE(30%醇洗物)；D：50%EE(50%醇洗物)；E：70% EE(70%醇洗物)；F：标准品

通过各标品标准曲线(表1)计算，可得芒萁粗黄酮中所含有的3种黄酮类化合物含量分别为：异槲皮苷0.856%、木犀草素-5-O-葡萄糖苷1.462%、阿福豆苷2.155%。

表1 黄酮标准品线性关系

2.3 芒萁黄酮体外抗氧化试验结果

本研究选择了黄酮纯度最高的50%EE进行试验，以评价芒萁黄酮的抗氧化能力。

2.3.1 芒萁黄酮对羟基自由基的清除能力 当浓度较低(< 200 μg/mL)时，芒萁黄酮的·OH清除能力略强于Vc，但是随着浓度递增，达到400 μg/mL及以上时，Vc的抑制效果明显好于芒萁黄酮。芒萁黄酮、Vc对羟基自由基的IC50值分别为：1 079.01、301.02 μg/mL(图4)。

图4 芒萁黄酮与Vc对羟基自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of dicranopteris pedata flavonoids and Vc on hydroxyl free radicals (·OH)注：*表示同一浓度下的值差异显著(P<0.05)，** 表示同一浓度下的值差异极显著(P<0.01)，无标志表示同一浓度下的值差异不显著(P>0.05)，下图同

2.3.2 芒萁黄酮对ABTS+的清除能力 在本试验条件下，芒萁纯化黄酮对ABTS+自由基的清除率与浓度几乎呈线性关系。在低浓度时芒箕黄酮对ABTS+自由基的清除效果远不如Vc，但在400μg/mL的浓度下，芒萁黄酮的清除效果达到Vc的78.01%。如剂量再提高，有可能会进一步缩减两者的差距。芒萁黄酮、Vc对ABTS+自由基的IC50值分别为248.74、40.34 μg/mL(图5)。

图5 芒萁黄酮与Vc对ABTS+自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of Dicranopteris pedata flavonoids and Vc on ABTS+

2.3.3 芒萁黄酮对DPPH自由基的清除能力 芒萁黄酮对DPPH自由基的清除率同样也存在剂量依赖，随浓度增加清除率提高较快，近线性关系。芒萁黄酮、Vc对DPPH自由基的IC50值分别为50.14、2.74 μg/mL(图6)。

图6 芒萁黄酮与Vc对DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of Dicranopteris pedata total flavonoids and Vc on DPPH free radicals

3 讨论

目前，黄酮类化合物已在食品、化工、保健食品等多个行业广泛应用，是多种医药、护肤品、食品添加剂的重要成分[11]。芒萁作为药用草分布广泛，根据丁利君等[7]的研究，其全株黄酮含量达到13.56%，是开发和利用黄酮的优质原料[8]。陈少美等[20]发现，不同采集部位对芒萁黄酮成分与含量的影响较大，其中以主根中含量最高(28.06%)，依次是老叶(22.05%)、嫩叶(15.32%)、老茎(9.64%)、嫩茎(5.94%)。本研究以芒萁茎叶为原料，运用超声波法辅助法提取芒萁黄酮的提取率为13.42%，与上述研究中的茎、叶黄酮含量平均值接近。同时，运用本方法提得的芒萁黄酮得率，远高于同类方法提取紫花苜蓿(0.64%)、辣木叶(4.89%)的黄酮得率[17-18]，说明芒萁黄酮含量高，较易提取，在生产上具有较好的应用前景。倪再辉等[19]检测出芒萁中含有芦丁、槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚5种黄酮类物质。毛娟玲等[10]于芒萁纯化后的二氯甲烷部分中鉴定出 15 个黄酮类化合物，于正丁醇部分中鉴定出 19 个黄酮类化合物。本研究在芒萁黄酮粗提物和各梯度醇洗物中鉴得阿福豆苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷和异槲皮苷3种黄酮类化合物，其中木犀草素-5-O-葡萄糖苷和异槲皮苷系首次在芒萁中发现。陈少美等[20]认为芒萁不同部位、不同采集时间对黄酮成分与含量影响较大，或为产生差异的原因之一。同时，提取途径和纯化方法的差异也是影响黄酮类物质鉴定的重要因素。

植物源黄酮具有很强的抗衰老和抗氧化能力，在增益机体免疫调节功能、促进人类和家畜健康以及预防慢性病等方面发挥重要作用[21-24]。因其具有抑制并清除活性氧的特性，可用于抵御氧化损伤。其机理是从黄酮类物质骨架上的羟基取代基电离出氢原子，来中和氧自由基，再与已电离的黄酮类物质结合，生成防止逆向结合的双体[25-26]。丁利君等[7]的研究中发现芒萁的水提液对羟自由基有很好的清除效果，而其乙醇提取液却不能清除羟自由基。但本研究中纯化后的芒萁黄酮能够很好地清除羟自由基，这与曾伟[27]的研究结果相一致，这可能是纯化后黄酮成分与含量不同所致。芒萁纯化黄酮在对3种不同自由基的抑制效果上表现出较大差异，推测与其所含成分的协同作用、单体结构有关，芒萁成分与抗氧化活性的构效关系还有待更深层次的探讨。

4 结论

本研究通过超声波辅助醇提法对芒萁茎叶黄酮的提取率为13.42%，纯化所得50%醇洗物部分的总黄酮含量最高，达76.25%，主要含有阿福豆苷(2.155%)、木犀草素-5-O-葡萄糖(1.462%)、异槲皮苷(0.856%)3种黄酮类物质。芒萁黄酮清除·OH、DPPH、ABTS+自由基的IC50值分别为：1 079.01、248.74、50.14 μg/mL。表明芒萁黄酮含量高，抗氧化活性优良。