浅谈植物细菌诊断技术

曲彦达 刘文钰

（沈阳工学院生命工程学院 辽宁抚顺 113122）

植物病害防治在食品质量和生产中具有重要的作用，作物感染病原菌（如细菌、病毒和真菌）造成的粮食损失是农业生产中长期存在的问题[1]。病原体、动物和杂草造成的损害占全球农业生产力损失的20%～40%。了解和控制植物病害的基本前提是做好早期检测和鉴定病原，防止疾病传播和食物损失。

目前，投入作物生产的全部预算限制了病原菌检测方法的常规使用，有学者提出采用先进的病害检测方法，最大限度地减少和预防作物在生长、收获和收获后加工过程中的病害危害，并最大限度地提高生产力，确保农业可持续发展[2]。

在植物病虫害中，重点研究了植物病原菌及相关诊断技术。这些类型的病原体对作物的生产力和产量造成毁灭性的影响。曼斯菲尔德及其同事[3]根据科学/经济重要性，描述了细菌性植物病原体“TOP10”清单。这项调查允许建立一个按顺序排列的名单：紫丁香假单胞菌致病菌；青枯菌；根癌农杆菌；稻叶枯单胞菌；野油菜黄单胞菌；黄单胞菌；果胶杆菌和萎缩果胶杆菌。这份名单是部分的，因为没有考虑其他重要的病原体，如分枝杆菌和沙氏假单胞菌。

植物病原菌可以在不同的环境中生存：在植物中作为病原体，在宿主之外作为腐生植物和附生植物。不利的环境条件可能会降低细菌存活率，并危及疾病的发生和传播[4]。相反，当病情好转时，可能出现感染周期。降雨、受污染的农业设备和/或植物材料、昆虫促进了植物细菌的传播。由细菌引起的疾病症状包括叶斑病、枯萎病、枯萎病、结痂病、溃疡病、肿瘤和根的软腐病等。

1 细菌病原检测与鉴定

植物症状观察是疾病管理的第一步，采用光学方法观察。一系列国际文件中描述，疾病的检测和/或鉴定实际上是实施植物检疫措施的关键步骤。国际植物检疫措施标准（ISPM）第27 号描述了官方诊断受管制有害生物的程序和方法，并提供了可靠诊断的最低要求。

诊断方法可作为检测植物基质中细菌的筛选试验和/或鉴定纯化细菌培养物特性的试验。筛选试验直接评估病原菌在植物基质中是否存在，可以利用不同的技术进行。当需要进行快速诊断时，这些分析尤其有用，因为大量种子/植物繁殖材料、等待检疫诊断、商业贸易对象在机场或港口受阻。当筛选试验结果为阴性时，可迅速移取材料，反之，阳性结果则需在纯培养基上进行分离和鉴定试验，以确认结果[5]。

目前，基于显微镜、血清学、生物化学、生理学、营养学、分子工具和培养繁殖等不同原理的一些技术被用作诊断工具。

血清学提供了细菌性疾病的间接证据，而基于广谱聚合酶链反应（PCR）技术的应用，允许对细菌进行特异性检测和鉴定。事实上，分离和培养繁殖仍然是“黄金”方法，也是准确诊断的关键步骤[6]。

分离为研究新出现的细菌性疾病提供了一些不可替代的优势，因为分离可以补充致病性分析，但也可以发展抗原研究、抗生素或替代化合物测试、敏感性实验模型、遗传研究和分类研究。在细菌诊断中，致病性试验和生物测定是最后确认的必要条件，特别是在出现新的症状时，或在诊断检疫细菌时。此外，分离允许建立用于维持细菌菌株的培养物集合。

利用以下方法分离细菌性植物病原菌：（1）选择性培养基，以阻止或延迟非靶向腐生菌或污染细菌的生长；（2）添加了特定基质的培养基，该基质只能被目标细菌降解，该培养基能够赋予生长菌落特定颜色[7]。

细菌鉴定阶段包括基于不同生物学原理的至少两项试验（如生化、血清学和/或分子试验的组合）或基于病原体基因组中不同DNA 序列靶点的两项分子试验。事实上，对一种可疑的植物细菌病原体的最终鉴定通常需要通过适当接种宿主植物进行致病性试验。超敏反应试验（HR）对某些病原菌（如植物病原假单胞菌和淀粉性欧文氏菌）是有用的，但对其他细菌种类则几乎没有反应[8]。

然而，传统的检测方法有一些缺点，如细菌培养通常需要数天或数周的时间，这在需要快速、高通量检测的情况下是至关重要的。如果有必要区分密切相关的有机体（低特异性），可能很难根据单一的整体形态特征来区分细菌物种。如果植物材料中存在低负荷（低敏感性），则这些方法不允许检测病原体。不同的论文讨论了诊断技术的积极和消极方面，以及免疫和核酸技术相对于传统诊断方法具有的优势[9]。

2 分子方法

分子测试可以基于杂交或扩增技术，并且可以是高度特异的。大多数细菌病原体检测方法检测DNA，DNA 比RNA 更容易制备，也更稳定。

杂交技术利用探针作为单链DNA 或RNA 分子，用放射性同位素、酶或荧光染料等报告分子标记。探针识别目标样本上的互补DNA/RNA序列，然后检测信号。根据报告分子的类型，检测步骤可能使用放射性或光（化学发光）。探针可以从双链基因组、克隆或PCR 衍生的DNA 中产生。

近年来，分子诊断方法采用的PCR 技术比杂交技术更为灵敏、简便、快速。也是在实验室应用最多的检测技术。然而，与单用PCR 相比，在基于PCR 的技术中集成探针可产生更敏感、更特异或更简单的诊断方案。第一，传统的实验室PCR 检测需要在反应后取出反应液，通过电泳后在紫外灯下观察结果，这就避免不了污染的问题，导致结果产生假阳性，对文章下结论会产生一定的影响。而探针法在全封闭的条件下进行PCR 扩增和产物分析，这就大大避免了污染的可能性。第二，PCR 扩增经常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响对条带的判断，探针法通过特异性的探针杂交信号检测产物，提高了检测的准确性。

3 图像光谱技术

光谱和成像技术在农业中的应用为植物病害的自动无损检测提供了可能性。其中，荧光、多光谱或高光谱成像、红外光谱、荧光光谱、可见/多波段光谱和核磁共振（NMR）光谱是用于植物病害检测的植物细菌检测方法。在植物细菌病害中，荧光光谱法被用来检测柑橘溃疡病引起的机械损伤。荧光参数的变化提供了病原体感染的指示。可见光谱和红外光谱已被用作快速、无损、经济的植物病害检测。高光谱成像技术在精密农业和胁迫检测中的应用正获得越来越多的发展，不同的植物病原菌也报告了高光谱成像通过测量感染时生物物理和生化特性变化引起的反射变化[10]。高光谱图像集样品的图像信息与光谱信息于一身，由于光谱信息能充分反映样品内部的物理结构、化学成分，内部结构的差异可以通过特定波长的光谱值来表现。在每个特定波长下，xy平面内每个像素点的灰度值又与其在该波长下的光谱值之间一一对应。图像信息可以反映样品的形状、缺陷等外部特征，由于不同成分对光谱吸收有不同的影响，在某个特定波长下图像对某个缺陷会有较显著反映，这些特点决定了高光谱图像技术在农产品内外部品质的检测方面的独特优势。许多研究人员利用分子方法配合光谱技术去验证植物疾病的病原。

4 总结与展望

近年来，在植物病原检测方面的一些研究使得新的开发方法能够在更短的时间内获得结果，如免疫试纸等，有时比传统的微生物检测具有更高的性能。然而，这些新方法需要验证。通过早期发现来预防疾病的发展和传播，是正确管理和控制疾病的一个有价值的策略。植物病害的检测，应通过在野外开发新型传感器系统，在早期快速、准确、可靠地进行。通过对受感染植物的早期诊断，可以避免疾病的传播。无症状植物可以成为病原菌的贮存库，发展具有提高敏感性、特异性的诊断方法，有助于植物病原菌的鉴定，即使在没有疾病症状或明显病原菌迹象的情况下。目前疾病诊断的突破在于光谱、成像技术和以挥发性有机代谢物作为生物标记物，随着技术不断发展，可以期待在植物细菌检测领域的新投入诊断。新技术需要具备非侵入性和适用性。农民的兴趣在于解决植物病害引起的问题，以快速、实时、无损的方法查明病害的感染情况，以便及时采取干预和预防措施，遏制感染，减少作物损失。

在不久的将来，开发、测试和完善可用于原位检测植物病害的准确诊断方法，专为田间使用而设计新的植物病鉴定技术。但是，以可移动生物传感器的形式进行采样和使用该技术可能在逻辑上具有挑战性。由于植物叶片具有庞大而复杂的基因组，可能难以获得现场DNA 测序的专业知识。对于数据挖掘和分析，高通量计算生物学和信息学将至关重要。目前，没有采取任何措施来改善可有效鉴定细菌植物病原体的可运输DNA 测序生物传感器。使用遥感设备进行测序将有助于识别多种细菌植物病原体，这是生物传感器在植物病诊断中的一个重要研发方向。开发小型、经济、高效、准确、简单的仪器，使未经培训的人员也可以在现场轻松地使用仪器去检测细菌植物病成为现今的主流需求。