非洲猪瘟病毒荧光PCR检测在养殖环节的应用

陈天慧 王立娇 刘洋 王世奇 张贺朋 张晶新 顾英俊 崔新燃 王保中

（北京市房山区动物疫病预防控制中心 102488）

非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。具有病程短和死亡率高等特点，比传统猪瘟病毒致病性更强。自2018年我国发生非洲猪瘟疫情以来，给养猪业造成极大的经济损失。利用荧光PCR检测非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)是当前诊断最有效的手段，对基层疫情排查、养殖场安全监管、屠宰场宰前检测有重要意义[1]。在开展非洲猪瘟病毒荧光PCR检测过程中，经过长期大量试验，总结出检测环节常见问题及预防措施，为基层兽医实验室开展日常非洲猪瘟病毒检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

活猪无菌采集EDTA抗凝血或口鼻拭子（pH7.2PBS缓冲液)；病死猪无菌采集肝、脾、淋巴结等组织样品；环境样品采集畜舍墙面、地面、污水、料槽；车辆样品采集运输车辆的车头、车尾、车厢、轮胎等。饲料样品覆盖猪场及饲料厂不同饲养阶段。2019年1月至2020年12月，在房山区生猪养殖过程中共采集23230份样品，其中组织样品25份，抗凝血1805份，口鼻拭子20630份，饲料样品66份，环境样品542份，车辆样品162份。

1.2 检测仪器及试剂

qTower3荧光定量PCR仪，analytikjena公司产品；NPA-32P全自动核酸提取仪，杭州博日科技有限公司产品；HR40-ⅡA2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司产品；NU-543-300S生物安全柜，美国Nuaire公司产品；SQ510C全自动高压灭菌器，重庆雅玛拓科技有限公司产品；SSW-420-2S型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司产品；Sorvall ST16R高速冷冻离心机，Thermo Fisher公司产品。

核酸提取试剂盒，购自杭州博日科技有限公司；非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒，购自青岛立见诊断技术发展中心。

1.3 检测方法

参照非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书进行。

1.4 结果判定

阳性对照的Ct值应﹤35且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效。被检样品Ct值﹤40且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无Ct值或Ct值≥40，判为阴性。

2 结果及常见问题分析

所有样本的Ct值为“无”或Ct值≥40，结果表明，所有被检样品均为ASFV抗原阴性。由于基层兽医实验室应用荧光PCR等分子生物学方法开展大规模病原学检测较少，在检测过程中会出现试验不成立、假阳性、假阴性、复测结果不一致等4种常见问题。

2.1 试验不成立

阳性对照无曲线或Ct值﹥35，出现这种情况的主要原因是阳性对照反复冻融。阴性对照Ct值﹤40，主要原因是实验室环境污染或加样过程中人为操作造成阴性对照污染。

2.2 假阳性

出现假阳性的主要原因有检测功能区域设置不合理、人员物品流向不合理、样品提取与试剂配制未在独立的生物安全柜中进行、检测人员操作不规范、核酸气溶胶污染、样品或提取模板间交叉污染、试验结束后清洁消毒不彻底等[2]。

2.3 假阴性

造成假阴性的原因主要涉及样品问题和人为因素两个方面。样品问题主要存在于抗凝血，肝素会抑制PCR反应，应用EDTA抗凝管，样品量过少会导致EDTA在全血溶液中浓度过大，对扩增结果造成干扰，导致假阴性。此外Ct值﹥35的检测样品受环境、操作手法等影响较大，且随着保存时间延长可能导致复检结果阴性[3]。人为因素包括试验操作不当漏加样品、人工标记的记号阻碍荧光信号收集、重复复测等。

2.4 复检结果不一致

引起复测结果不一致的原因有检测试剂反复冻融、同一样品灭活前后Ct值不同、样品前处理不离心匀浆导致病毒分布不均匀、溶血样品血红素含量差异大、混样量太多。

3 讨论

荧光PCR检测方法具有灵敏度高，特异性强，在生猪养殖环节被广泛应用于非洲猪瘟日常排查和疫情诊断。在检测过程中，由于PCR试验受实验室环境、样品种类、人为操作、检测试剂和检测仪器等多种因素影响，使得PCR试验出现上述4种问题。笔者通过查阅大量文献及结合平时的工作经验，从“人、机、料、法、环”5个方面提出预防措施，加强兽医实验室建设，做好实验室生物安全，提高检测人员技术水平，减少PCR试验误差。

3.1 人

加强检测人员的培训考核工作。所有从事PCR检测人员应经培训考核合格上岗，掌握PCR的原理、方法，按照标准及作业指导书的要求进行规范操作，熟悉相关仪器设备性能，并能按照标准规定的程序熟练操作，避免因人为操作失误造成试验误差和污染。在ASFV检测的样品制备阶段，样品需60℃水浴灭活30min，样品处理必须在生物安全柜或负压实验室进行处理。加液（样本、反应体系)时，应先离心匀浆，小心开盖以防液体飞溅或产生气溶胶。加样时应最后加阳性并设置对照，防止样品污染。

3.2 机

实验室应配备满足检测需求（包括样品处理、试剂制备、核酸提取、PCR扩增、数据处理与分析)的设备和设施。仪器设备应通过计量认证，确保检测数据的准确性。不同区域的仪器设备不能通用，特别是样品处理的生物安全柜与试剂配置的生物安全柜不能混用。生物安全柜在试验前进行紫外消毒30min，试验过程中有污染随时擦拭消毒；试验操作结束后及时对操作区域及使用过的移液器等物品进行化学消毒，继续使生物安全柜通风至少10min，过滤试验过程中产生的气溶胶污染，通风结束再次紫外消毒30min。

3.3 料

试验所需的检测试剂和生产的废弃物要妥善保管及处置。检测试剂应做到先进先出，专人保管。阳性标准品应按照检测样品量合理分装，避免反复冻融。二级生物安全实验室不具备保存ASFV病料的生物安全条件，当天检测样品需及时高压处理。所有含有核酸耗材不能高压消毒的应直接放入含消毒剂的自封袋内密封处理。扩增产物严禁暴露于空气中，避免产生气溶胶污染。液体废弃物需经过消毒液浸泡处理后密封，固体废弃物需在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后再移出，交医疗废弃物处理公司处置。

3.4 法

加强兽医实验室体系建设，制订质量与生物安全管理手册、程序文件、作业指导书、质量记录表格。相关内容一定要具有科学性、合理性、可操作性，确保检测有法可依，有据可循，随时查阅，方便操作。

3.5 环

按照分子生物学试验要求，非洲猪瘟病原学检测需严格实验室分区，设置试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区、PCR产物分析区，做到区区分离，人和物单向移动，防止交叉污染的发生。实验室内的样本液和扩增产物是气溶胶的主要污染源，实验室要经常通风换气，保证通风设备运行良好。严格执行实验室消毒制度，每次试验前后用消毒液擦拭工作台面及可能接触到核酸的冰箱、门、窗等把手处，用75%酒精擦拭仪器设备，再用紫外灯照射整个实验区域不少于30min。

4 结论

通过对2019～2020年房山区养殖环节中采集的23230份样品采用非洲猪瘟实时荧光PCR方法进行检测，结果均为ASFV抗原阴性。经过大量试验总结出检测环节易出现试验不成立、假阳性、假阴性、复测结果不一致等4种常见问题，从“人、机、料、法、环”5个方面提出相关预防措施，为基层兽医实验室开展日常非洲猪瘟病毒检测提供参考。作为动物疫病防控部门，我们要根据防控形势的变化，有针对性地加强非洲猪瘟养殖环节的检测，积极开展疫情分析评估和预报预警，有效提升风险防范能力和水平，坚决打好打赢非洲猪瘟疫病防控战。