致病性胚系突变在胰腺癌中的研究进展

汪展辉 马小雨 邵成浩

1海军军医大学第二附属医院普外四科，上海 200003；2海军军医大学第二附属医院骨肿瘤科，上海 200003

【提要】 BRCA1、BRCA2、ATM和MSH等基因的致病性胚系突变(PGAs)与胰腺癌的发生发展密切相关。PGAs的胰腺癌患者主要依靠胚系基因检测协助诊断。BRCA 1、BRCA2、ATM等基因突变的患者对铂类化疗和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂治疗更加敏感，而错配修复(MMR)相关基因突变的患者更能受益于免疫检查点抑制剂。本文对目前主要的PGAs类型和相应的检测及治疗手段进行综述。

胰腺癌发病隐匿，进展迅速，超过80%的胰腺癌患者在确诊时已经丧失根治性手术的机会，这意味着化疗是大多数胰腺癌患者的主要治疗方法[1]，然而化疗效果并不理想。大约10%的胰腺癌患者伴有致病性胚系突变(pathogenic germline alterations，PGAs)[2]，这部分患者更有可能从靶向治疗中受益。越来越多的证据表明胚系基因检测对于胰腺癌患者具有协助诊断和指导进一步治疗的价值[3-5]，本文对目前主要的PGAs类型和相应的检测及治疗手段进行综述。

一、胰腺癌相关的PGAs

胚系突变是指在个体胚胎发育期已经携带的变异(源于父母生殖细胞中产生的突变)[6]，其中能使某些疾病患病风险提高的变异即PGAs。目前已发现的胰腺癌相关的PGAs基因主要有BRCA 1、BRCA 2、PALB 2、ATM、CDKN2A、MLH 1、MSH 2、MSH 6、PMS 2、EPCAM、STK 11、SPINK 1、PRSS 1和CFTR等[7]。这类基因发生胚系突变主要与某些遗传性癌症综合征的发生密切相关，同时也增加了胰腺癌的患病风险。

1．同源重组修复相关基因：同源重组修复(homologous recombination repair，HRR)是DNA损伤修复的一种重要方式，主要利用姐妹染色单体作为模板，修复DNA末端断裂的基因组序列。HRR相关基因发生突变容易导致同源重组修复缺陷(homologous recombination deficiency，HRD)，增加癌症发生的风险。

BRCA基因在HRR中起重要作用，BRCA 1、BRCA2胚系突变可导致HRD，以致发生乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌以及前列腺癌的风险增加[8]。BRCA 1、BRCA2是胰腺癌中最常见的胚系突变基因，4%～7%的胰腺癌患者具有BRCA 1、BRCA2胚系突变。此外，有研究发现BRCA 1、BRCA2体细胞突变也与胰腺癌的患病风险相关，约2%的胰腺癌患者伴有BRCA 1、BRCA2体细胞突变[9]。PALB 2是BRCA 2的配对和定位基因，协同BRCA 2参与HRR作用，PALB 2胚系突变同样会导致HRD，增加患者发生胰腺癌的风险[10]。

ATM为共济失调毛细血管扩张突变基因，在细胞周期调控、DNA损伤应答(DNA-damage response,DDR)和HRR中发挥重要的调控作用。ATM胚系突变增加了对各种癌症的易感性，主要与白血病和淋巴瘤的风险增加相关，约5%的遗传性胰腺癌患者携带该基因的胚系突变[11]。

除此之外，BARD 1、CHEK 2、FANCA和FANCC等基因也参与HRR作用，并且在胰腺癌患者中也检测到了相应的胚系突变[7]。

2．错配修复相关基因：错配修复(mismatch repair, MMR)基因主要包括MLH 1、MSH 2、MSH 6、PMS 2，在正常细胞和癌细胞DNA复制和基因重组过程中对识别和修复错配碱基起着重要作用[12]。MMR基因和EPCAM基因的胚系突变往往引起错配修复缺陷(mismatch repair deficiency, dMMR)，从而导致微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)，增加林奇综合征和胰腺癌的患病风险[13]。

3．其他基因：CDKN2A为细胞周期依赖性激酶抑制基因，是一种重要的抑癌基因，通过抑制cyclinD-CDK4和cyclinD-CDK6复合物启动G1/S期转变，调节细胞周期进程。CDKN2A胚系突变主要与黑色素瘤的风险增加有关，同时也增加了胰腺癌的患病风险[14]。

STK 11是一种抑癌基因，该基因的胚系突变与常染色体显性遗传病黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)密切相关，并易患胃肠道息肉病，增加乳腺癌、胃肠道肿瘤及卵巢癌的风险。PJS患者发生胰腺癌的风险也显著提高[15]。

SPINK 1、PRSS 1、CFTR胚系突变虽然不是胰腺癌的直接影响因素，但也和胰腺癌有一定的关联，主要与慢性胰腺炎的发生密切相关，增加患者发生胰腺癌的风险[7]。

二、PGAs的检测技术

胚系基因检测是确定患者是否伴有PGAs的主要手段，需要对受试者的外周血(主要方式)、口腔黏膜或唾液等取样进行检测。具有胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌家族史或患有遗传性癌症综合征是需要进行胚系基因检测的主要指征，然而有研究发现约42%不具有相关检测指征的胰腺癌患者也能检测出PGAs[3]。目前，美国国家综合癌症网络(NCCN)指南和美国临床肿瘤学会建议对所有新诊断的胰腺癌患者进行胚系基因检测。近年来，基因检测技术在不断发展，在PGAs方面的应用主要有以下几种方法。

1．Sanger测序法：Sanger测序法是指1977年Sanger等发明的双脱氧链终止法，可得到序列的直接信息，测序读长可达1 000 bp，且碱基读取准确率高达99.99%，目前仍是基因检测的金标准，也是方法学比较和家系内部验证的主要手段。Sanger测序法最大的优势是准确，但其成本较高，通量低，测序耗时长。

2．高通量测序技术：高通量测序技术(next generation sequencing, NGS)也称二代测序技术，采用边合成边测序的基本原理，可以同时将几十万到几百万条DNA分子进行测序，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。与Sanger测序法相比，NGS具有通量高、测序速度快、成本低等优势，是迄今为止应用最为广泛的测序技术。基于高通量测序技术的多基因面板能够在较短时间内同时检测多个基因，已经成为检测遗传性癌症风险基因的主要方式。有研究根据MCCN指南建议及相关文献，设计检测范围相对全面的多基因面板，用于检测已发现的和潜在的胰腺癌易感基因[16-18]。

3．高分辨率熔解曲线技术：高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting, HRM) 建立在实时荧光定量PCR基础上，通过提高解链温度来检测变性双链DNA中的荧光强度变化，再通过解链图区分出野生型和突变型，可用于单碱基序列变异和未知突变的发现[19]。该技术具有高通量、高灵敏度、自动化程度高、成本低等优势，但对PCR产物的质量要求较高。随着HRM检测仪器、DNA饱和染料及HRM分析软件的进一步开发，HRM的应用也日趋广泛。

三、PGAs胰腺癌的治疗

1．铂类化疗：目前胰腺癌的一线铂类化疗方案主要有FOLFIRINOX(奥沙利铂、伊立替康、亚叶酸钙、氟尿嘧啶)以及顺铂联合吉西他滨。铂类药物发挥抗肿瘤作用机制的主要途径是通过与DNA形成加合物，限制DNA的解旋从而抑制DNA的复制[20]。Wattenberg等[5]已经证明铂类化疗可以提高BRCA 1、BRCA 2或PALB 2胚系突变的晚期胰腺癌患者的总体生存率。这类基因的胚系突变会导致HRD，由于不能有效地修复损伤的DNA，携带HRD的肿瘤对铂类药物更加敏感。除了BRCA 1、BRCA 2和PALB 2，ATM、BARD 1、CHEK 2、FANCA和FANCC发生胚系突变的胰腺癌患者同样能够受益于铂类化疗[2]。也有研究发现，BRCA 1、BRCA 2体细胞突变的胰腺癌患者也能受益于一线铂类化疗[9,21-22]。

2．聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)抑制剂：协同致死效应这一概念起源于果蝇模型系统的研究，是指单一基因的缺陷不会对细胞产生杀伤作用，但两种或多种基因同时缺陷可以杀伤细胞。后来这一概念被引申和应用到肿瘤研究领域，促使研究人员确定某一主要突变基因的协同致死基因是否存在，或通过某些条件(如缺氧、代谢变化或DNA损伤药物的应用等)达成协同致死效应[23]。2005年，Bryant等[24]首先发现了乳腺癌和其他癌症中的BRCA 1、BRCA 2突变与PARP抑制剂之间的协同致死效应，为肿瘤治疗提供了一种新手段。PARP是一种DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用。正常情况下抑制肿瘤细胞中PARP的活性，可以导致其单链DNA断裂的积聚；但肿瘤细胞内存在其他修复系统，如BRCA 1、BRCA 2所介导的同源重组途径，可以修复DNA损伤、维持染色体的稳定。因此，抑癌基因BRCA 1、BRCA 2缺陷或突变的癌细胞对PARP抑制剂的敏感性是正常细胞的1 000倍，这使得PARP抑制剂成为BRCA 1、BRCA 2缺陷相关胰腺癌的特效药物[25]。与铂类化疗相似，BRCA 1、BRCA2体细胞突变的胰腺癌患者同样受益于PARP抑制剂[4,9,21]。

目前已研发的用于临床的PARP抑制剂主要有奥拉帕尼(olaparib)、尼拉帕尼(niraparib)、鲁卡帕尼(rucaparib)、维利帕尼(veliparib)、塔拉唑巴(talazoparib)等，并且有30多项PARP抑制剂治疗胰腺癌的临床试验正在进行[23]。最近报道的POLO实验[8]评估了奥拉帕尼作为维持疗法在BRCA 1、BRCA 2胚系突变的转移性胰腺癌患者中的疗效：将经过了4个月一线铂类化疗且病情稳定的患者分为奥拉帕尼治疗组与安慰剂组，继续接受维持治疗，结果显示奥拉帕尼治疗组患者中位无进展生存期明显延长(7.4个月比3.4个月)，总体反应率显著上升(23.1%比11.5%)，中位应答持续时间增加6倍以上(24.9个月比3.7个月)。这项研究证明了以PARP抑制剂为代表的靶向治疗对PGAs胰腺癌具有显著的治疗效果。PALB 2、ATM、BARD 1、CHEK 2、FANCA和FANCC等胚系突变也会导致HRD；根据协同致死效应，具有相关突变的胰腺癌患者也很可能受益于PARP抑制剂，该领域还需要进一步研究。

3．免疫检查点抑制剂：近几年来，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)在肿瘤治疗领域发展迅速，目前已上市的药物主要有PD-1单抗、PD-L1单抗以及CTLA-4单抗。免疫检查点分子是起到免疫抑制作用的调节分子，在生理条件下对维持自身耐受、防止自身免疫反应至关重要；而肿瘤细胞能利用这一抑制效应来逃避免疫反应。ICIs通过抑制这类调节分子(如PD-1、PD-L1以及CTLA-4)，避免肿瘤细胞的免疫逃逸[26]。随着多项临床试验发现ICIs对伴有dMMR的肿瘤患者具有较好的疗效，美国食品药品监督管理局(FDA)在2017年5月批准ICIs治疗MSI-H/dMMR相关的癌症[27]。有几项相关报道[13,28-30]证明了MMR缺陷的胰腺癌患者受益于ICIs，这提示了ICIs治疗在MLH 1、MSH 2、MSH 6、PMS 2和EPCAM胚系突变胰腺癌患者中具有应用前景。

目前，胰腺癌患者是否伴有PGAs主要依靠胚系基因检测来确定，并且有一部分患者能受益于铂类化疗、PARP抑制剂以及免疫检查点抑制剂治疗。对PGAs相关靶点和治疗手段的探索以及对ICIs应用于dMMR胰腺癌患者的临床试验可能是未来的研究方向。

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