类器官技术在胰腺癌研究中的应用与展望

席晓宇 李冰 郑少杰 钟长青 李连勇

战略支援部队特色医学中心消化内科，北京 100101

【提要】 类器官是应用体外3D培养技术建立的结构和功能上类似于器官的小型组织，具有组织自我更新及可长期培养的特点。近年来，肿瘤类器官模型作为一种新的模型，在肿瘤发生机制、药物筛选、精准医疗、器官移植等领域有广泛的应用前景。本文重点讨论类器官在胰腺癌研究中的构建及应用研究进展。

目前，胰腺癌研究领域中常用的模型是肿瘤细胞系(patient-derived cancer cell lines，PDC)和人源肿瘤异种移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)。PDC培养条件简单，体外可无限增殖，但其无法模拟肿瘤体内生长环境，不能代表肿瘤本身的异质性，缺少空间组织性和多种细胞类型等[1]。PDX能够在一定程度上模拟体内微环境，也能较大程度保留肿瘤异质性，但存在实验周期长、移植成功率低、成本高等局限性，这在很大程度上限制了临床研究的进展[2]。近年来，体外3D肿瘤细胞培养模型，尤其是类器官模型受到了研究者的广泛关注。与PDC和PDX相比，肿瘤类器官可以更近似地模拟来源组织的结构、功能及生长环境，具有培养成功率高、培养周期短、保真性高等优点。因此，类器官技术在肿瘤的发生发展机制研究、药物筛选、个体化治疗研究、器官移植等方面具有广阔的应用前景，已成为消化系统肿瘤研究的热点。本文就类器官在胰腺癌研究中的构建及应用做一综述。

一、类器官的概念

类器官是利用干细胞的自我更新及分化能力，在体外培养形成的一种在细胞成分、组织架构及特定功能等方面与相应器官高度相似的小型组织，实现了在体外培养环境中对特定器官的复制[3]。由于类器官具有可大规模培养、培养时间较短、保真性高等特点，故成为肿瘤研究和治疗的可靠模型。近年来已有多种肿瘤类器官成功构建，并应用于肿瘤基因组学及抗肿瘤药物筛选等，特别是为个性化癌症治疗开辟了新的视野。

二、胰腺癌类器官的构建

肿瘤类器官是保留原发肿瘤组织学和遗传学特征的原发肿瘤细胞三维培养物，其培养需要初始条件(包括起始细胞类型)、物理条件(基质胶)、生长因子及信号传导。胰腺癌类器官构建一般来源于外科手术切除的肿瘤标本或活检组织，比如细针穿刺。在一项大规模的队列研究中分离和传代的胰腺癌类器官模型在切除肿瘤标本及细针活检之间具有相当的相似性(>70%)，这使得在胰腺癌的各个阶段都能产生类器官模型[4]。活检组织经过酶处理后，可嵌入基质内或在气液界面培养。胰腺癌类器官构建需要添加EGF(分裂素)、R-spondin-1(增信号)、 Noggin(抑制BMP信号)和Wnt3a等，另外还需烟酰胺、FGF10(丝裂原)、A83-01(Alk抑制剂)、前列腺素E(PGE、丝裂原)，进行长期扩增[5]。初始培养条件根据原始组织中起始细胞的类型选取不同的培养基，胰腺癌类器官的基础培养基一般为Advanced DMEM/F-12培养基。在最佳生长状态下，胰腺癌类器官可在20～45 d左右形成。胰腺癌类器官的构建方法目前随着研究不断改进，构建成功率与培养速度也逐渐提高。

三、胰腺癌类器官的应用与研究

1．在胰腺癌发生发展机制中的研究：肿瘤从发生、发展到恶化、转移及药物抵抗是一个复杂的多环节相互联系的过程。而利用类器官技术建立不同演变阶段的肿瘤模型，可以为肿瘤各阶段机制的研究工作提供可用的优质平台。研究表明胰腺癌的发生与多种基因改变有关，如致癌基因(K-ras等)的激活和抑癌基因(TP53、p16/CDKN2A、SMAD4、BRCA2等)的失活。目前已知有MAPK、Wnt、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT等信号通路参与。胰腺癌进展过程中也存在大量基因改变，如K-ras、TP53基因突变造成Wnt、MAPK、Notch信号持续激活，易导致肿瘤发生。2015年，Boj等[6]率先报道了小鼠和人胰腺癌的3D类器官模型，可以移植到免疫缺陷小鼠体内，产生类似胰腺上皮内瘤变的侵袭前病变，进而表现出侵袭性腺癌并转移的特异性。Moreira等[7]采用RNAseq和质谱分析对小鼠胰腺三维器官进行了基因表达和蛋白组学分析，观察到基因和蛋白组学特征与胰腺肿瘤的进展有关。Bailey等[8]结合了来自456个胰腺癌全基因组、外显子和RNA测序分析定义了4种不同的胰腺导管腺癌亚型(鳞癌、胰腺祖细胞肿瘤、免疫原性亚型和异常分化的内外分泌肿瘤)，并将每种亚型与特定的分子通路、组织病理学特征和生存率联系起来，其结果有助于发现潜在的靶向治疗方法。以上研究均显示，胰腺癌类器官为胰腺癌发生机制和特定基因功能的研究提供了一个全新的平台。

2．在抗肿瘤药物筛选中的应用：近年来，包括免疫治疗药物在内的靶向药物改善了患者的预后，但部分患者仍无法从现有治疗中获益。由于肿瘤异质性的存在，患者个体差异和药效之间存在密切关系，甚至同一肿瘤中不同癌细胞对药物的反应也有显著差异。胰腺癌通常发现较晚，只有10%～15%的患者可行手术治疗，而对无法手术切除的胰腺癌患者，类器官为抗肿瘤药物精准筛选提供了可靠的选择，从胰腺癌患者的肿瘤组织中提取并构建的类器官用于高通量药物筛选，更有助于筛选有效药物[9]。Tiriac等[10]利用156例患者来源的类器官，建立了一个平台来测试单药化疗和靶向药物治疗，结果显示胰腺癌类器官的治疗效果与患者的结果相一致。Huang等[11]研发出了一种利用三维细胞培养技术从胰腺癌患者组织中扩增和培养原代癌细胞类器官，并进行了药物检测。研究者使用吉西他滨和表观遗传抑制剂处理5例患者的肿瘤类器官，结果显示5个样本对药物有不同的敏感度，且敏感度与耐药生物标志物呈正相关，胰腺癌类器官能够在体外保留患者组织本身对新型药剂的敏感性。尽管这是一个小样本测试，但它证明了使用类器官技术研究测试肿瘤异质性的可行性，此技术有望建立多个患者肿瘤组织的活体样本库用于研究个体患者的特异致病机制，有助于针对性研究和个体化的药物测试[12]。

3．在胰腺癌个体化治疗中的研究：个体化治疗是肿瘤治疗的趋势，而胰腺癌类器官模型可用来进行有针对性的研究和筛选靶向药物[13-14]。研究表明，肿瘤反应、进展与器官样体对特定治疗方案的敏感性、耐药性之间有良好的相关性，这表明器官样体系统可预测治疗结果[15]。随着胰腺癌生物活体组织库的建立，研究者使用肿瘤和邻近正常的器官进行了深入的基因组和转录组分析，从而对肿瘤特异性的DNA和RNA变异进行比较和识别，利用自动化定量高通量筛选系统，可以更好地发现和验证新型药物，模拟和研究靶向药物[16]。在临床肿瘤治疗中，可以单一或组合药物进行敏感性筛选，然后在个体胰腺癌类器官模型中进行验证，确定每个患者的药物治疗有效方案，进而实现个体化治疗。目前使用胰腺癌类器官进行个体化治疗的研究有限，但在这些初步研究结果的支持下，相信未来胰腺类器官可进一步推进胰腺癌的个体化治疗。

四、胰腺癌类器官的局限性

类器官具有显著优势，但仍存在一定局限性。首先类器官通常保留多个类型细胞，模型中缺乏神经、血管及免疫细胞，限制了类器官在筛选靶向药物的应用。其次，类器官构建中需要使用基质胶，而基质胶的复杂性和组分的可变性使得培养环境难以完全统一，且基质胶的应用会影响药物的渗透。此外，在类器官培养过程中需要添加生长因子及化学试剂，这可能会造成细胞基因突变或生长发育异常，从而影响药物试验结果。

五、小结与展望

胰腺癌类器官是当前研究的热点课题，相关研究领域正在蓬勃发展。在药物敏感性筛选方面，胰腺癌类器官具有高通量、高特异性的特点，可大幅度缩短临床前试验与临床试验的周期、降低开发成本与风险，为精准药物治疗提速。在发病机制和治疗方面，胰腺癌类器官具有高保真性，可以深入研究疾病的发生发展机制。此外将基因编辑技术引入胰腺癌类器官模型中，可以更加灵活和准确地在基因层面操作胰腺癌类器官，使精准医学研究成为可能。但该技术目前尚不成熟，有许多问题需进一步探究，如人体中的免疫成分、血管成分和神经成分无法在目前的类器官系统中很好地体现；肿瘤类器官的培养环境仍与肿瘤在人体生长的微环境有一定差距；培养基基质及培养基中的成分需进一步标准化；培养体系有待进一步优化；利用胰腺癌类器官所进行的体外药敏试验仍需进一步与临床结合等。相信随着类器官技术的发展，胰腺类器官技术在疾病模型、药物开发及个体化治疗领域将取得长足进展。

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