从分子生物学角度探究胚胎停育相关影响因素的研究进展

黄凌佳 杨舒奇 孙欣 黄明莉

胚胎停育的定义为早孕期(妊娠12周以内)的胚胎丢失或胎儿停止发育的病理过程，影像学诊断提示空孕囊或无胎心的胎儿。随育龄期妇女中发病率的逐年增高，探讨胚胎停育原因的研究也在不断发展及细化。随着分子生物学的发展，研究发现胚胎停育组织中存在细胞过度凋亡和胎盘血管增殖不良[1]，以及免疫调节过度的现象。各种各样参与不同途径的分子标记物被用于胚胎停育妊娠组织的研究，本文总结了近十年研究热点的标记物，按作用机制分析，从滋养细胞异常侵入与黏附、胎盘及绒毛血管生成、调节滋养细胞过度凋亡、细胞免疫调节机制、调节子宫内膜蜕膜化这五个方面分别介绍这些分子标记物具体的作用途径，探究胚胎停育具体的发病机制。

一、滋养细胞异常侵入与黏附

1. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类结构中含有Zn2+、Ca2+的蛋白酶[1]，能够特异性降解细胞外基质及基底膜。基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)作为其特异的抑制剂，通过与有活性的MMPs中高度保守的Zn2+结合位点结合，抑制MMPs作用[2-3]。研究发现胚胎停育患者蜕膜组织中，MMP-2及MMP-9的表达水平明显高于对照组，TIMP-1作为MMP-9的特异性抑制剂，其表达水平明显低于对照组。在胚胎植入及胎盘形成过程中，子宫内膜细胞外基质的适当降解和滋养细胞侵入内膜之间的某种平衡状态能够保证胚胎成功着床和发育[4]。在孕6～8周，MMP-2是滋养细胞侵入作用的主要蛋白酶，在孕9～12周，MMP-2及MMP-9同时对滋养细胞侵入起作用。在早期滋养细胞侵入和子宫螺旋动脉重塑过程中，这些蛋白酶水解蜕膜基质及基底膜，为胚胎绒毛外滋养细胞的侵蚀消除物理屏障[1]。同时研究表明，MMP-2、TIMP-1及TIMP-2对血管建立有重要作用，胚胎停育组织的绒毛和蜕膜中TIMP-1表达明显下降，母胎界面不能形成正常妊娠需要的低阻力血管，使滋养层功能不良，胚胎缺乏血氧供应，同时MMP-2及MMP-9表达上调，造成滋养细胞异常侵入，导致胚胎停育[5-6]。

2. E-钙粘连蛋白(E-Cadherin，E-cad)是一种钙依赖黏附分子，广泛表达于上皮细胞，主要功能介导特定组织和器官同型细胞间的黏附作用，维持上皮细胞的完整性和极性[7]。有研究发现，E-cad参与胚胎正常发育、组织形成和滋养细胞的侵蚀活动，妊娠早期滋养细胞表面均有E-cad的黏附与表达，这样有利于胚泡的黏附与植入[8-9]。E-cad水平表达的高低可以有效反映滋养细胞的浸润能力。有研究用qRT-PCR技术发现在胚胎停育蜕膜组织中E-cad在mRNA水平表达增加，子宫内膜从增殖期到分泌期过渡时，子宫内膜腺上皮细胞表达E-cad水平逐渐增加，而分泌期过渡到蜕膜期，E-cad表达水平则下降[8]。当滋养细胞需要进一步与子宫内膜相容时，上皮细胞表达的E-cad降低，使子宫内膜腺上皮细胞相互粘附力降低，有利于滋养细胞入侵。研究证实，在胚胎停育患者的绒毛组织中E-cad的高表达，影响滋养细胞与子宫内膜的兼容性，无法形成胚胎正常发育的微环境，同时阻碍绒毛血管的重铸，造成胎盘浅着床，从而导致胚胎停育的发生。有国外学者提出，E-cad的正常表达受SLIT/Roundout(Robot)信号的调节[10]，同时SLIT2/Roundout1(Robot)的单链化可能引导滋养细胞的迁移及浸润。随着妊娠的进展，E-cad在各绒毛部位表达有所下降，这有助于滋养细胞的侵入，保证滋养细胞层的正常生理功能，维持胚胎的正常发育。

二、胎盘及绒毛血管生成

胚胎及胎儿的生长发育与胎盘绒毛血管发育关系密切，而胎盘绒毛血管的形成过程实际上就是血管内皮细胞的生长发育过程，本文总结了以下两个热门研究的分子标记物。

1. miR-126(MicroRNA-126)基因组:miR-126(MicroRNA-126)基因组定位于表皮生长因子样结构域7(epidermal growth factor-likedomain7,EGFL7)基因的第七个内含子中，EGFL7本身就是血管内皮特异性表达的基因，因而两者共同对血管的形成、发育及功能起调控作用[11]。Sehmid等研究将小鼠的EGFL7基因敲除后部分胚胎死于血管发育异常及异常的胚胎干细胞聚集[12]。生物信息学分析发现，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是miR-126的预测靶基因之一，miR-126与VEGF在胚胎正常发生、发展过程中起正向调节作用，miR-126在正常妊娠时可以通过抑制Spred1基因，提高内皮细胞对VEGF和成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的敏感性，参与胚胎血管的新生并维持血管的完整性[13]。在针对研究 miR-126 在肺癌中的表达发现，上调 miR-126 可以明显抑制 VEGF 的表达，对肿瘤的生长和转移起抑制作用。国内学者针对 miR-126 与 VEGF 的表达进行相关性分析中发现两者在胚胎停育组中呈负相关，提示 miR-126 与 VEGF 在胚胎停育的发生、发展中有负向调节作用，miR-126可能直接抑制VEGF基因的表达，从而使胚胎血管发育减少或功能异常[13]。

2. VEGF是一类具有高度特异性的促血管内皮细胞有丝分裂原，是血管生成最重要的调节因子[14]，形态学分析提出VEGF的表达区域正是绒毛血管形成区域，它操控了胎盘血管网络的完整建立。其中VEGFR属于酪氨酸激酶受体，分布于血管内皮细胞上，有VEGFR1及VEGFR2及VEGFR3三个受体，其中VEGFR2发挥主要作用，学者们对VEGF的深入研究后发现，VEGF表达下降会削弱内皮细胞侵袭、迁移及增殖功能，使血管通透性相关活性因子表达下降，导致绒毛及蜕膜血管生成减少，绒毛滋养细胞植入过浅，胎盘血管网路建立不完善，影响母胎间血流供应及物质交换，最终导致胚胎停育的发生[13]。国外学者对母体螺旋动脉重塑及滋养细胞侵入的过程研究发现，低氧诱导因子α(hypoxia inducible factor-1，HIF1)/VEGF与绒毛血管生成之间存在正相关关系，HIF1α/VEGF在调节绒毛血管生成有重要作用[15]，已知HIF1调节细胞适应低氧状态，稳定的HIF1与细胞核结合，并与多个靶基因(比如VEGF)的低氧反应元件结合，参与调节血管生成。实验发现人滋养细胞中HIF1信号的丢失与流产有关[15]。本文推测胎盘血管的发育可能是通过激活HIF1α信号通路及其靶点VEGF来实现。

三、滋养细胞过度凋亡

1. 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)是一类蛋白酶家族。Caspase家族在细胞凋亡途径中起主要作用，是启动和执行细胞凋亡关键的凋亡蛋白[16]。起细胞凋亡执行者作用的是caspase3,6,7。研究证实，正常妊娠早期滋养细胞存在凋亡现象，而滋养细胞的增殖与凋亡处于一个动态平衡状态。针对胚胎停育的绒毛和蜕膜组织研究发现，胚胎停育组织中Caspase-3 RNA和蛋白表达较对照组显著升高，提示胚胎停育的发生机制可能是细胞增殖与细胞凋亡比例失衡[17]。Caspase-3 RNA和蛋白在胚胎停育组织的高表达，可能启动了线粒体/细胞色素C介导的细胞凋亡途径，导致细胞滋养层和胎盘滋养层中的细胞凋亡比例增高，大量凋亡的滋养细胞使滋养细胞层正常功能受损，阻碍胚胎正常生长发育，造成胚胎停育[18]。

2. 研究发现大量的微RNA(MicroRNA)对胎盘的发育和功能起着重要作用[19]。据报道，正常妊娠有一定程度的滋养细胞凋亡，是一种正常的生理现象，这有利于绒毛和绒毛分支的形成与发育，然而当滋养细胞过度凋亡时，会导致绒毛发育不良或者滋养细胞变性[20]，高水平的凋亡可能是导致胚胎停育的主要原因[21-22]。实验证明，在miR-575的模拟实验组中，p53基因表达上调，当用miR-575抑制剂转染实验组人绒毛膜癌细胞后，p53基因的表达明显下降，细胞凋亡率明显下降，提示miR-575可能通过调节绒毛细胞凋亡维持胚胎的正常发育。同时实验进一步研究发现，miR-575抑制剂转染细胞组的B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)蛋白的表达也显著降低，进一步表明miR-575在绒毛细胞中的凋亡作用[23]。成功的妊娠不仅取决于细胞的凋亡，还取决于足够的绒毛血管生成，能够为胚胎提供足够的氧气和营养[24]。有学者研究miR-575与绒毛血管生成的关系发现，miR-575的过度表达显著降低了VEGF和人类血管生成素-2(Human Angiopoietin 2，Ang-2)的表达，用miR-575抑制剂转染的细胞组，VEGF/Ang-2的表达水平明显升高，表明了miR-575在绒毛血管中也起到了调节作用[19]。因此，我们总结miR-575不仅可以作为胚胎停育的生物标记物，也可以作为未来预防性治疗胚胎停育的潜在分子靶点。

四、细胞免疫调节机制

TIPE是肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8[25-29]家族中的一员，是一种新发现的炎症和免疫调节因子[25]，其中TIPE2是一种新发现的免疫抑制剂，在炎症和免疫维持中表现出负调节作用[30]。Sun的Westernblot实验结果表明TIPE2阳性染色主要存在于蜕膜腺上皮细胞的细胞质、蜕膜血管的内皮细胞及基质细胞中，而且TIPE2蛋白在流产及胚胎停育患者的蜕膜组织中表达明显下调[25]，有学者进一步分析TIPE2与免疫因子TNF-α、IL-10的相关性，发现TIPE2与IL-10的表达成正相关，TIPE2可以通过下调促炎细胞因子和炎症细胞的有丝分裂来抑制炎症细胞的活化。对于妊娠这一生理过程来说，巨噬细胞M2极化也是人类早期妊娠成功的重要因素[31]。有报道提出，TIPE2蛋白通过激活PI3K-AKT信号通路促进巨噬细胞M2的分化[32]，从而维持妊娠。所以TIPE2在维持母胎免疫耐受性方面起着重要作用，在母胎免疫耐受的机制中，可以下调促炎细胞因子的过度表达及炎症细胞的有丝分裂，降低母体免疫系统对胎儿的过度免疫识别及应答，从而保证胚胎的良好发育。同时有学者提出，TIPE2可以抑制各种癌细胞的侵袭[33]，早期胚胎的着床和胎盘的形成建立在滋养细胞成功侵入母体子宫内膜的基础之上，一旦滋养细胞侵入过强，导致蜕膜组织中的胶原过度水解，使蜕膜组织坏死脱落，从而导致胚胎停育的发生。TIPE2在这一过程中可以抑制滋养细胞的过度侵袭，维持蜕膜组织的正常形态和生理功能，从而维持胚胎正常发育，但滋养细胞的侵袭具有局限性，具体机制有待进一步研究验证。

五、调节子宫内膜蜕膜化

妊娠是一个非常复杂却又精细的生理过程，卵子被排出后，增殖期的子宫内膜在雌孕激素的共同作用下转化为分泌期子宫内膜，这就是蜕膜化的过程。这是胚胎植入与正常发育的基础条件。蜕膜化是一个需要多种细胞因子、激素及免疫细胞、信号转导分子共同参与的过程[34]。

1. 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是诱导骨生长的重要因子，研究发现黄体来源的黄体酮(P4)可能通过Ihh-Nr2f2-Bmp2信号轴作用于Bmp2的下游因子Wnt4进而激活Wnt信号通路来调控蜕膜化的过程。泌乳素(prolactin,PRL)是子宫内膜蜕膜化的公认标记分子，P4可以促进子宫内膜基质细胞分泌PRL，PRL可以正向促进黄体酮及其受体表达，加强上述信号通路作用。实验证明Bmp2在正常早孕蜕膜组织表达强阳性，在胚胎停育蜕膜组织中表达弱阳性及阴性，正常早孕蜕膜细胞的PRL表达明显高于胚胎停育组织。国外学者研究发现，在子宫内膜蜕膜化的孕激素信号中Bmp2是重要的调控因子，条件敲除雌鼠Bmp2基因，雌鼠会因蜕膜化失败而导致不孕，人Bmp2重组蛋白可以显著增强体外诱导蜕膜化反应[35]。因此推测Bmp2可作为子宫内膜蜕膜化反应中重要的调控因子。

2. 胰岛素样生长因子结合蛋白-1(Insulin like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)作为子宫内膜蜕膜化的重要参与者，可与胰岛素样生长因子、胰岛素、卵巢激素、细胞因子等共同参与调控胚胎种植和胎儿生长。蜕膜化IGFBP-1浓度过高造成子宫内膜容受性下降，胚胎种植障碍进而导致流产发生，IGFBP-1表达降低还与胎盘形成不良有关[36]。

综上所述，胚胎的正常发育是一个复杂而精密的过程。子宫内膜正常蜕膜化，滋养细胞的绒毛及蜕膜血管网络的建立，母胎免疫机制等这些过程都是胚胎正常发育必须经历的环节。在这个过程中，每一个环节都不是孤立的，众多分子水平标记物将一个个环节紧密衔接起来，协同完成一个完整的妊娠过程。本文总结了上述目前作为研究重点的分子标记物，希望为胚胎停育发病机制的进一步研究提供帮助和思路。