复发性外阴阴道假丝酵母菌病的免疫机制及免疫治疗

许莹莹 刘萍 冯勤梅

75%的妇女一生中至少感染一次外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)，有10%左右的女性会因为某些原因在一年内感染4次或以上而发展成为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)[1]。尽管使用抗真菌药物能减少感染，但是复发率很高，很难治愈。因此探究RVVC病因以及寻找更为精准的治疗方法具有重要的临床意义。RVVC反复发作的机制尚不完全明确，常见的诱因有糖耐量异常、雌激素水平波动、长期应用免疫抑制剂及广谱抗生素等[2]。90%的RVVC患者的发病是由白假丝酵母菌病原体引起，但绝大多数患者的发病并没有明确的诱因，因而考虑个体异质性及遗传易感性因素可能是影响RVVC易感性的主要因素。本文对近年RVVC发病的相关免疫机制及免疫治疗研究进行总结。

一、RVVC发病的固有免疫机制

1.多形核中性粒细胞缺陷：机体通过固有免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)与假丝酵母菌表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)结合，产生释放防御素、细胞因子等杀灭病原菌。此过程中多形核中性粒细胞(polymorphonuclear，PMN)大量聚集，引起阴道上皮细胞损伤，造成RVVC的症状性感染。然而大量PMNs的聚集并没有清除假丝酵母菌，而是导致阴道粘膜处于慢性炎症状态[3]。因此推测PMN反应以及趋化因子缺陷是造成宿主易感性的一个重要原因。阴道分泌物中的硫酸乙酰肝素会作为假定的竞争性Mac-1配体干扰PMN与假丝酵母菌的相互作用，造成PMN功能障碍，导致RVVC[4]。PMN功能障碍相关机制的探索对于RVVC免疫靶向性治疗有很大的价值。

2.MBL 基因多态性：甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)是天然免疫系统的一部分，可以结合在念珠菌细胞壁表面，启动补体激活系统，减少感染。研究表明，MBL2基因的多态性，特别是在codon 54(变异等位基因 B；野生型等位基因A)，携带MBL2等位基因B的女性发生RVVC的风险增加了3倍[5]。有研究认为MBL2 Y/X多态性与RVVC的易感性有关，携带等位基因X的妇女患VVC的风险比携带Y的妇女高1.52倍[6]。Babula等[7]研究表明，与对照组相比，白细胞介素-4(interleukin，IL)T/T基因型RVVC患者阴道灌洗液中IL-4浓度增加2倍，MBL浓度降低2倍，考虑免疫因子水平的降低可能增加RVVC的易感性，表明IL-4中-589T/C 与RVVC易感性有关。鉴于血清及阴道分泌物中MBL水平会受到基因多态性及其他细胞因子的影响，因此MBL基因型的分析可作为MBL血清水平的替代物来识别缺乏MBL的女性，从而能够给予相应治疗，例如尚待证明有效性的MBL蛋白。

3.Toll样受体及Dectin-1基因多态性：Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)是发现最早的一种模式识别受体，TLR2与树突状细胞C型植物血凝素1(Dectin-1)协同诱导炎性细胞因子，Dectin-1也可以通过脾酪氨酸激酶/胱天蛋白募集域蛋白9(spleen tyrosine kinase/cysteone recruitment domain protein 9，Syk/CARD9)依赖通路诱导IL-17、IL-6和IL-10的产生。TLR2Pro631His多态性通过降低γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-17水平使得RVVC的易感性增高3倍[8]。此外，Dectin-1(Y238X)中的早期终止密码子突变导致β-葡聚糖识别和辅助性T细胞-17(helperT-17，Th17)应答的缺陷。但是有研究[9]表明，RVVC易感性与伊朗人群Dectin-1Y238X多态性之间没有显著相关性，这些差异可以归结为不同种族之间的遗传异质性，表明有必要对不同人群中的基因多态性进行研究来更精准地指导治疗。

4.NLRP3基因多态性：核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域蛋白3(nucleotide binding oligomeric domain like receptor family pyrin domain protein 3，NLRP3)是炎性小体的重要组成部分。炎性小体是一类由PRRs参与组装的多蛋白复合体，能够识别PAMPs或者宿主来源的危险信号分子。NLRP3通过胱冬肽酶-1(caspase-1)激活IL-1β和IL-18。研究发现NLRP3基因的等位基因7与RVVC发病的频率增加有关[7]。Jaeger[10]等人分析发现RVVC患者及对照之间12/9基因型差异比较明显(P=0.02)，进一步研究表明携带12/9基因型的RVVC患者阴道表面IL- 1β的产生高于对照组，IL- 1Ra水平下降，IL-18水平保持不变。这些结果表明，NLRP3/IL-1β通路在RVVC的发病机制中起着重要作用，因此可作为RVVC潜在的治疗靶点。

5. IL-22基因突变：细胞因子IL-22的突变也会增加RVVC易感性[11]。产生IL-22的细胞很多，新近发现的固有淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)存在于粘膜屏障表面，乳酸杆菌可以通过产生芳香烃受体配体，通过ILC3促进IL-22的产生，IL-22可以通过控制假丝酵母菌的生长形态来增加抗菌肽的产生，也可以通过磷酸化信号转导与转录激活因子3(signal transduction and transcriptional activators，STAT3)来保持上皮细胞的完整性。IL22基因rs2227485位点的TT基因型与RVVC发病风险降低具有显著的相关性(OR=0.48，P=0.01)。

二、RVVC发病的适应性免疫机制

适应性免疫包括体液免疫和细胞免疫，其中又以Th及其相关免疫因子为代表的细胞免疫作为阴道局部抵抗假丝酵母菌的主要适应性免疫防御机制。Th主要包括Th1、Th2及Th17 、调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)。

1. Th1/Th2平衡破坏：Th1表达IL-2、IL-8、IL-12、IFN-γ等细胞因子提高免疫活性来抵抗假丝酵母菌的侵袭。Th2表达的IL-4、IL-6、IL-10 与感染的持续和慢性化相关，对Th1应答有抑制作用进而使机体对真菌易感。Th1与Th2平衡破坏会使Th1介导的正常预防性反应转变为Th2反应，使宿主出现一种迟发型过敏反应。Neves[12]研究表明单用氟康唑治疗无效的RVVC患者联合口服抗组胺药西替利嗪治疗可缓解症状。White[13]应用抗过敏药扎鲁斯特治疗20例 RVVC 患者也取得了一定的效果，提示过敏反应可能参与RVVC的感染。

2. Th17/Treg平衡破坏：Th17分泌IL-17激活其他促炎因子、粒细胞趋化因子、抗菌肽及基质金属蛋白酶防御假丝酵母菌。吲哚胺2，3-双加氧酶/芳香化烃受体(indoleamine dioxygenase/Aromatic hydrocarbon receptors，IDO-AHR)轴控制着Th17/Treg的免疫平衡[14]。IDO1基因rs3808606的TT基因型也与RVVC的易感性相关(OR=0.51，P=0.02)[11]。此外，梁轶珩等[15]通过测定不同时期 Th17 相关细胞因子变化，表明缓解期 IL-17A 的正常表达对预防RVVC有重要作用。因此维持细胞免疫的平衡对于预防RVVC的复发有着重要意义。

三、RVVC治疗中微生态制剂的应用

随着阴道微生态概念的提出，乳酸杆菌也逐渐被证明是阴道微环境中的有益菌，它可以通过竞争排除致病菌，竞争营养素，生成抗菌物质，激活免疫系统来维持健康的阴道菌群[16]。乳酸杆菌可以通过增加活性氧、IL-8、IL-6、IL-12等的产生，上调NF-κB及TLR-2信号通路，增加巨噬细胞的吞噬和杀菌活性[17]。实验观察到阴道中乳酸杆菌和假丝酵母菌共同存在可以减少真菌的粘附，且卷曲螺杆菌可以诱导上皮细胞产生人防御素2(human beta-defensin 2，HBD-2)[18]。表明乳酸杆菌通过激活免疫细胞的免疫效应，刺激免疫细胞分泌各种细胞因子，调节机体的免疫状态来恢复阴道菌群。李军英[19]研究表明抗真菌药物联合微生态制剂治疗RVVC的总有效率高达92.5%，复发率为2.5%，显著优于仅使用抗真菌药物治疗患者的62.5%和32.5%(P<0.05)。一项前瞻性研究[20]表明应用11001 l型乳酸杆菌片协同单剂氯丙唑500 mg治疗可使VVC的复发风险降低3倍。因此可以考虑将乳酸杆菌转化为克隆载体，利用其自身的作用或者携带假丝酵母菌抗原来达到治疗RVVC的作用。

四、RVVC疫苗

疫苗的作用是促进抗原特异性免疫反应，并引发针对特定致病菌株的保护性免疫记忆。白假丝酵母菌是一种多态真菌，菌丝态毒力更强。酵母菌细胞壁是PRRs-PAMPs相互作用的中枢，决定下游的免疫反应。当假丝酵母菌侵袭人体时，菌丝表面黏附素和侵袭素会与宿主上皮细胞的相应受体结合促进黏附；同时菌丝尖端分泌水解酶和溶解素，侵袭和破坏细胞膜的完整性，减弱宿主细胞的防御能力[21]。因此可以根据假丝酵母菌的抗原性来制备疫苗，相关疫苗可以分为三种：活减毒株，糖偶联物和重组蛋白。

1.减毒活株疫苗：由于白假丝酵母菌的菌丝态毒力更强，制备减毒活株疫苗普遍采用去除菌丝结构的方式达到减毒作用。小鼠实验已经证明了几种无毒或低毒力的假丝酵母菌突变体的保护作用，但是由于现有实验减毒活株疫苗缺少稳定性，考虑到其应用的安全性，并未进入临床试验[22]。

2.糖偶联物疫苗：糖偶联物疫苗由聚糖制备，该种聚糖在真菌细胞壁中常见，在宿主细胞中不存在。其中β-葡聚糖是假丝酵母菌细胞壁的关键成分，可能与宿主细胞粘附有关。体外和体内研究显示来自海带属及其衍生物的海藻的β-葡聚糖可诱导最初的细胞因子的活化，引发依赖Dectin -1的固有免疫反应，进而增加吞噬细胞杀伤微生物的潜力。具有佐剂的β-葡聚糖缀合物可能有助于诱导产生抗β-葡聚糖抗体的疫苗，其能够抵抗多种真菌的侵袭作用[23]。

3.重组蛋白疫苗：重组蛋白疫苗主要由与真菌毒力相关的蛋白质组成，不含病原体，因此对人体更安全。目前的研究表明，最强的适应性免疫记忆反应是针对与菌丝相关的蛋白质。凝集素样序列基因(agglutinin-Like Sequence，Als)表达于酵母菌菌丝，有助于酵母菌粘附和侵入人体内皮。NDV-3是一种含有Als3抗原的疫苗，研究表明应用NDV-3A制备的疫苗在RVVC患者体内诱导了强烈的抗体和T细胞免疫反应，在12个月的研究期间，有RVVC病史的小于40岁的患者复发的时间间隔延长(接种疫苗患者210天，安慰剂患者105天)[24]。该疫苗的作用效果可以通过测定血清中IgG2的抗体滴度来评价[25]。

分泌型天冬氨酰蛋白酶(secretory aspartic acid protease，Sap)是白假丝酵母菌分泌的一种胞外蛋白酶，将Sap2与病毒颗粒重组得到疫苗PEV7，大鼠体内注射PEV7后可以在阴道分泌物中检测到IgG和IgA的产生。在Ⅰ期临床试验中，无论肌肉注射还是阴道给药，在受试者血清、阴道样本中均观察到快速特异的B细胞介导的免疫应答[26]。菌丝调节蛋白1(yeast-hyphal regulational gene，Hyr1)是一种糖基磷脂酰肌醇——锚定型甘露聚糖蛋白，在菌丝形成过程中表达，可以抑制先天免疫系统杀灭假丝酵母菌的能力。研究表明使用大肠杆菌重组制备Hyr1可以使小鼠免受假丝酵母菌的侵袭[22]。

综上所述，RVVC的高发生率和常规抗真菌疗法的不足构成了对开发免治疗的强烈的医学需求。考虑到机体的局部免疫在其中起着重要作用，外源性细胞因子，抗体和免疫调节剂的使用是潜在的研究方向，联合疫苗也因为其可能更有效地防止不同位点和组织特异性的假丝酵母菌感染，将会是未来的研究热点。当然这些方案仍需在临床上进行更大样本量的研究来证实。继续探讨发病的相关免疫机制，进一步的实验验证免疫制剂有效性和安全性，可能对推动RVVC临床治疗方式的进展起到非常重要的作用。