氧化应激反应与骨关节炎相关性及抗氧化应激药物应用的研究进展

夏干清综述 周庞虎审校

骨关节炎是全球最为常见的关节疾病，而软骨的退行性改变、软骨下骨组织的改变及滑膜炎性反应都在疾病发生发展中起到关键作用。追溯其病因，包括外力、体质量等机械因素和衰老等其他生物性因素都参与其中[1]。这些因素最终导致了关节软骨细胞死亡，软骨软化缺失及骨赘形成，引发关节疼痛不适和患肢的活动受限，进而严重影响生活质量，且带来了较大的家庭及社会负担。

氧化应激是一种因机体代谢产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)与相应抗氧化剂防御机制之间的不平衡并且偏向于氧化剂增多而产生的现象，氧化应激是衰老的主要特征之一，能够广泛影响组织器官的正常功能[2]。此过程与机体内包括神经系统疾病、心血管系统疾病等病理过程密切相关。因软骨组织缺乏血供，软骨细胞曾经被认为生活在厌氧环境中。然而有文献指出实际上氧气可以扩散到关节软骨之中，其浅表和中部区域并不缺氧，这意味着氧化应激能够在关节软骨中产生影响[3-4]。正常情况下，ROS主要通过还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶在关节软骨细胞中低水平产生，并且能够调节软骨细胞凋亡、基因表达、细胞内基质合成和分解，以及细胞因子的产生，是维持软骨稳态的细胞内信号传导的重要角色。已有证据表明，骨关节炎软骨比正常软骨具有更多的ROS诱导的DNA损伤。此外，骨关节炎患者的抗氧化酶也有明显减少。可以认为，氧化应激参与并在骨关节炎发病中起到重要作用。

1 氧化应激在骨关节炎中的作用

1.1 衰老及异常机械应力因素诱发氧化应激 骨关节炎的发生通常分为两类，一类以年轻人为主要对象，主要由曾经的关节损伤引起，称为创伤后骨关节炎；而另一类则以中老年人为主要对象，与年龄因素息息相关[5]。在衰老的过程中，关节也相应发生一系列变化[6]。肌肉组织减少或体质量增加，骨细胞的减少及骨密度减低等因素改变了关节负荷和机械应力，从而影响了关节的正常功能，并引发关节炎性反应和氧化应激过程的产生。Koike等[7]通过切除内侧半月板建立小鼠骨关节炎模型，证明了在骨关节炎软骨中改变的机械应力可以在关节软骨中产生异常水平的ROS，且抗氧化物超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase-2, SOD2)下调，动态机械负荷可能是通过TRPV-4这类机械应力传感通道信号传导调节软骨细胞的线粒体内超氧化物的平衡，从而维持关节软骨细胞的稳态，由此可说明骨关节炎患者的ROS异常水平与其关节软骨机械应力的改变有关。需要注意的是，在骨关节炎关节内的氧化应激发展过程中，NADPH氧化酶复合物也扮演着重要角色。NADPH氧化酶复合物广泛存在于多种细胞，能够通过质膜传递电子产生ROS，从而参与到清除病原微生物等生理活动中。已有研究阐述了ROS和NADPH氧化酶复合物之间的联系，发生骨关节炎的关节中存在氧化应激过程，且关节中大量的ROS是由NADPH氧化酶复合物产生[8-10]。在整个氧化应激过程中，细胞内的线粒体既是产生ROS的主要位点，又是这些分子的主要靶点。另外，极光激酶A(Aurora A)的泛素化能够降低SOD2的表达并导致线粒体功能障碍[11]，从而参与骨关节炎的发生。ROS能够引起线粒体呼吸链抑制，ATP水平降低及mt-DNA的突变。而衰老过程中mt-DNA的突变和损失频率明显增高[10, 12]，这导致了功能受损的呼吸链亚基合成，并进一步导致线粒体呼吸链功能障碍和ROS的增加，形成恶性循环[13]。过量的ROS和抗氧化能力之间的失衡，最终导致了氧化应激[14-15]。过量的ROS还与DNA、蛋白质和脂质发生反应，破坏其正常结构，损害功能并对细胞产生一定的毒性。

1.2 过量ROS导致关节软骨细胞的减少 ROS包括羟自由基(OH-)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)、一氧化氮(NO)和次氯酸盐离子(OCl-)。在氧化应激的过程中，ROS通过不同的通路导致软骨细胞的死亡或是生长抑制，从而参与到骨关节炎的发展过程之中。有研究通过在兔关节软骨使用Withaferin A(WFA)证实细胞内ROS可通过PI3K/Akt和JNK通路引起软骨细胞的凋亡[16]。另外，ROS还通过NF-κB信号传导影响软骨基质的重塑、软骨细胞凋亡、滑膜炎性反应，并对下游软骨细胞分化的下游调节因子具有间接的刺激作用[17-18]。Vincent等[19]研究证实次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶(hypoxanthine-xanthine oxidase, HX-XO)系统产生的H2O2可以抑制关节软骨细胞的生长。一项研究使用氧化剂SIN-1诱导软骨细胞死亡后测定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)，证实随着衰老而增加的氧化应激使软骨细胞通过谷胱甘肽抗氧化剂系统的失调，而更容易受到氧化剂介导的细胞死亡的影响[20-21]。氧化应激不仅能够导致软骨细胞的凋亡，抑制其生长，甚至可以加速细胞衰老，这一过程可能与影响软骨细胞的端粒酶活性相关[22-23]。

1.3 氧化应激影响关节滑膜及关节软骨下骨组织 在关节滑膜中，氧化应激过程同样广泛存在。骨关节炎患者关节内的炎性反应及微环境改变可导致滑膜缺氧。在这种情况下，滑膜细胞适应缺氧环境产生能量并将其细胞代谢从相对静止的状态转变为高度代谢活跃的状态，而这种代谢转变导致代谢中间产物的积累，可能增加ROS的产生，导致氧化损伤和炎性反应[24-25]。氧化应激过程中产生的过量NO可以通过调节线粒体功能，增加p-53的表达及控制细胞周期的蛋白质来降低骨关节炎滑膜细胞的存活并诱导其死亡[26-28]。另外，在绵羊半月板切除的骨关节炎模型中，用NO供体化合物治疗会增加软骨下硬化，提示NO与软骨下骨硬化有着一定联系[29-30]。这些观察结果表明，氧化应激产物NO可能是骨关节炎中导致软骨下骨硬化的重要介质。

综上所述，包括外部机械应力或衰老等因素直接或间接参与了氧化应激的产生。氧化应激则通过诱导软骨细胞、滑膜细胞死亡，增加软骨下骨硬化等方式促成了骨关节炎的发展。

2 抗氧化应激药物治疗

在正常人体关节组织中，软骨细胞能够表达多种抗氧化剂，包括CAT、SOD和GPX。这些抗氧化剂水平的降低和过氧化物水平的增加会导致健康的关节软骨稳态丧失，从而随着年龄增长关节软骨发生病理性改变，并最终促进骨关节炎的发展。而针对此机制，现在已经有相关文献及报道提出将天然或人工合成抗氧化药物用于针对骨关节炎的治疗。

2.1 透明质酸(hyaluronan,HA) HA是由2个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。因为HA具有明显的润滑作用，是滑膜液的主要成分之一，长期被用于骨关节炎的临床治疗之中，以此缓解骨关节炎患者关节疼痛。在一项研究中，研究者在膝关节炎患者病变关节内注射HA，从而证实HA减少了关节滑膜液中脂质的过氧化[31]。此外，有报道称研究者使用Bio-press系统对牛的软骨组织施加一定的机械压力，随后测定蛋白聚糖(proteoglycan，PG)和ROS水平，证实机械压力抑制了PG的合成并增强了ROS。而后在外部使用HA，逆转了应力抑制PG的合成，减弱了ROS的合成[32]。这些数据表明HA作为抗氧化剂发挥了一定的抗氧化应激过程作用[33-34]。

2.2 维生素 维生素C和维生素E分别为水溶性和脂溶性的维生素，都具有一定的抗氧化能力。为了验证这2种抗氧化剂是否能够抑制骨关节炎患者中的氧化应激过程，Canter等[35]对维生素A、C、E和硒治疗骨关节炎进行了系统评价，没有明显证据证明维生素A、C、E或用硒联合治疗任何类型的关节炎是有效的。D'adamo等[36]报道使用精氨酸(SPD)来进行骨关节炎中抗氧化治疗的策略。在评估了经SPD预处理后的骨关节炎软骨细胞死亡程度、氧化DNA损伤和Caspase-3活化的程度后，证实SPD能够通过对Caspase-3和NF-κB产生影响来阻止氧化应激对软骨的破坏作用，且SPD治疗可增强软骨细胞的增殖。

2.3 自由基清除剂 自由基清除剂可以特异性针对骨关节炎患者的氧化应激过程，在机体正常代谢过程中及保护细胞和组织免受氧化损伤中具有重要作用。水溶性富勒烯(C60)和重组超氧化物歧化酶(SOD)均能有效地抑制氧化应激。C60可使所有循环的氧衍生自由基失活，从而抑制氧化应激诱导的基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-13)产生，并阻止下调人类软骨细胞中基质的产生、凋亡和过早衰老。在手术诱发的兔骨关节炎模型中，其保护作用被得到证实[37-38]。SOD是一种金属蛋白酶，它能够将超氧化物自由基歧化为过氧化氢和分子氧，从而减轻氧化应激过程大量ROS带来的影响。然而，在治疗中使用天然SOD有一定局限性，即由于它们的大分子限制了其细胞通透性，体内循环半衰期颇为有限。如今，一些模拟SOD的低分子化合物能够克服这些缺点。已有文献报道SOD模拟化合物MnL4的治疗可防止由氧化应激引起的组织变性改变，这给SOD类化合物能够克服天然SOD的缺点，并给治疗骨关节炎带来新的前景[39-40]。NF-E2相关因子2(Nrf-2)是一种调节抗氧化防御系统的关键转录因子，通过控制位于其靶基因启动子区域的抗氧化剂响应元件(antioxidant response element, ARE)激活其下游基因表达抗氧化酶类。最近一项研究表明，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)可通过激活Nrf-2阻止氧化应激从而在骨关节炎中发挥保护作用[41]。

2.4 褪黑素 褪黑素及其代谢产物被视为广谱抗氧化剂和自由基清除剂。实验表明褪黑素可抑制JNK和p38-MAPK的磷酸化，激活SIRT-1从而抑制软骨细胞死亡。在线粒体中，褪黑素还能够保护线粒体DNA免受ROS引起的氧化损伤。因而有研究认为褪黑素有望对骨关节炎的病情发展产生一定的缓解作用[42]。然而，关于褪黑素治疗骨关节炎的临床证据尚不充足，期待进一步验证。

2.5 中医药 传统中药在对抗衰老等方面累积了丰富的经验。近来不少研究发现，某些具有抗衰老功能的中药中的多肽类具有良好的抗氧化活性。独活寄生汤具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效，是治疗膝关节骨关节炎的经典药方，有研究通过临床对照试验，验证了独活寄生汤可通过参与NLRP3/NF-κB信号通路在骨关节炎中发挥抗氧化作用[43]。另外，一项应用化瘀除湿通痹方治疗肾虚血瘀型膝骨关节炎的临床试验中，观察组MDA、SOD水平均显著优于对照组，这表明化瘀除湿通痹方在抑制氧化应激反应上发挥了显著作用，而其具体机制仍待进一步探究[44]。

2.6 其他 当前天然成分的衍生药物快速发展，可以作为辅助OA的治疗方案。某些多酚类物质同样具有一定的抗氧化能力并且能够给骨关节炎治疗提供一定的思路。白藜芦醇是一种沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulation 2 homolog-1, SIRT-1)激活剂，可以保护软骨细胞，抑制骨关节炎的病情发展[45]。白藜芦醇能够以剂量依赖的方式增加SIRT-1蛋白的表达，通过激活SIRT-1的方式保护软骨细胞免受IL-1β刺激，从而避免了NO诱导的人软骨细胞凋亡。SIRT-1的上调还可以通过增加Bcl-2并降低Bax、MMP-1和MMP-13的表达，通过抑制p38、JNK和ERK的磷酸化来抑制骨关节炎软骨细胞凋亡和细胞内基质降解[46]。然而，关于白藜芦醇或其他SIRT-1激活剂的临床研究仍然较少，其治疗效果需要在临床试验中进行进一步研究和验证。此外，有研究显示，槲皮素在大鼠骨关节炎模型中通过消除软骨退变和减少膝关节软骨细胞凋亡起到保护作用， 其可能通过SIRT-1/AMPK信号通路减轻氧化应激过程，是一种有前途的骨关节炎治疗方法[47]。翠雀花素(delphinidin)能够抑制ROS引起的细胞凋亡，通过显著抑制如c-Caspase-3和c-PARP等凋亡信号，同时上调抗凋亡标记Bcl-XL和抗氧化相关的NF-κB和Nrf2通路实现对关节软骨的抗氧化应激保护和抗细胞自噬能力[48]。

3 小结与展望

综上，骨关节炎的形成发展与氧化应激有着密不可分的关系。机械应力、年龄增长等因素可以通过氧化应激的过程参与到骨关节炎的发展之中。氧化应激产生的失衡超氧化物不仅导致软骨细胞线粒体功能障碍，更能够促进软骨细胞凋亡，滑膜细胞死亡乃至关节软骨下骨化。目前有针对骨关节炎中氧化应激过程的药物，亦有能发挥抗氧化能力的辅助药物，其所展现的能力不容忽视，可能将给骨关节炎的非手术治疗方向带来广阔的前景。