Podoplanin-CLEC2活化血小板与肿瘤相关性的研究进展

李铭铭 岳晨曦 张梦琳 黄文娟 综述 王瑞涛 审校

癌症和血栓性并发症之间有着密切的联系。据报道，在恶性肿瘤患者中，静脉血栓栓塞(Venous thromboembolism，VTE)的发生率为10%～20%，动脉血栓栓塞(Arterial thromboembolism，ATE)的发生率为1%～4.7%[1-2]。癌症相关性血栓形成是导致肿瘤患者死亡的第二大原因[3]。

越来越多的证据表明，血小板活化在癌症相关性血栓形成中发挥重要作用。同时，癌细胞诱导的血小板活化还促进了肿瘤的发展和扩散。既往研究已经发现，平均血小板体积和血小板分布宽度与肾细胞癌、结直肠癌、黑色素瘤等肿瘤预后密切相关[4-5]。血小板聚集在肿瘤细胞周围可保护它们免受剪切力和血液中的自然杀伤细胞的伤害，并为肿瘤细胞提供了与血管壁粘附的支架。此外，活化血小板分泌的血管生成因子和生长因子可促进肿瘤生长和血管生成[6]。肿瘤细胞可通过表达膜蛋白Podoplanin刺激血小板活化。血小板表面C型凝集素样受体2(C-type lectin-like receptor-2，CLEC2)是Podoplanin的受体。研究证实，Podoplanin和CLEC2之间相互作用，通过活化血小板在肿瘤发生发展中发挥多种生理和病理作用。

1 Podoplanin与CLEC2概述

Podoplanin是血小板受体CLEC2唯一的内源性配体[7]。Podoplanin是一种36～43 kD的唾液酸蛋白样的单跨膜糖蛋白，由一个短的胞内结构域和一个胞外结构域组成，含有大量的丝氨酸、苏氨酸残基作为潜在的O-糖基化位点。Podoplanin具有四个血小板聚集刺激(PLAG)结构域，这些结构域具有重复性和高度保守性。其中，PLAG3和PLAG4两个结构域均含有谷氨酸、天冬氨酸双重肽和O-糖基化苏氨酸，它们是CLEC2和Podoplanin结合、诱导血小板聚集的重要部位[8]。CLEC2是分子量为32 kDa的Ⅱ型跨膜蛋白，属于非经典型凝集素样受体。CLEC2的胞质尾部具有半免疫受体酪氨酸基激活基序(hemi-ITAM)，Podoplanin与CLEC2两者结合后，该基序通过Src、Syk酪氨酸激酶的磷酸化介导细胞信号转导[9]。Syk通过其两个Src同源2结构域识别酪氨酸磷酸化，从而被激活。活化的Syk相互作用导致磷脂酶Cγ2(PLCγ2)磷酸化和激活，导致细胞内钙水平升高和蛋白激酶C活化，继而引发血小板活化[9]。

2 Podoplanin-CLEC2活化血小板参与肿瘤发生发展

CLEC2高表达于血小板和巨核细胞，少量由B细胞和髓细胞表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞亚群[9]。在恶性肿瘤中，CLEC2与表达Podoplanin的肿瘤细胞相互作用促进肿瘤进展。Podoplanin作为一种淋巴管内皮标志物在多种恶性肿瘤中高表达，如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、鼻咽癌、中枢神经系统肿瘤等[10-14]。Podoplanin的过度表达与肿瘤进展、肿瘤侵袭性和转移有关[11，15]。在Podoplanin表达阳性的小鼠肿瘤模型中，抑制Podoplanin表达可减少转移性肺结节的数量[16]。此外，Podoplanin在肿瘤内的高表达水平与癌症相关死亡率的增加有关[17]。根据最近的研究表明，Podoplanin的表达与许多实体肿瘤的更高分级级别和晚期有关[18]。

Podoplanin-CLEC2介导的信号传导途径目前仍在探索中。研究证实，Podoplanin胞质尾可结合细胞骨架结合蛋白(Ezrin-radixin-moesin，ERM)，进而与细胞质膜和肌动蛋白丝相互作用，可参与调节肌动蛋白细胞骨架的调节，促进细胞运动[6]，同时参与促进胚胎发育和癌症期间的上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[19-20]。此外，Podoplanin-ERM相互作用还参与淋巴管生成和免疫应答[20]，以及通过特殊的细胞表面突起(侵袭性足)募集糖蛋白，促进肿瘤细胞侵袭能力[21]。

2.1 Podoplanin-CLEC2促进肿瘤细胞增殖

Podoplanin-CLEC2与肿瘤细胞增殖密切相关。在口腔不典型增生患者中的研究发现，Podoplanin表达水平随着口腔上皮细胞异形程度的增加而增加，猜测Podoplanin表达程度可用于推测发生口腔癌变的风险[22]。Shirai等[23]报道，血小板与Podoplanin表达阳性的黑色素瘤B16F10细胞共培养，可明显促进细胞增殖。

2.2 Podoplanin-CLEC2促进肿瘤远处转移

2.2.1 Podoplanin-CLEC2促进肿瘤血行转移 远处转移是恶性肿瘤最主要的特征之一，主要包括血行转移、淋巴道转移。Podoplanin通过血小板受体CLEC2诱导血小板聚集，有利于肿瘤细胞的血行转移。Xu等[24]为了探讨阻断Podoplanin对肿瘤生长和转移的抑制作用，建立了恶性黑色素瘤异种移植模型。然后从小鼠尾静脉注射抗Podoplanin封闭抗体SZ168，结果显示小鼠黑色素瘤的生长和肺转移受到明显抑制。此外，将抗CLEC2抗体2A2B10注射到小鼠体内，随后注射表达Podoplanin的黑色素瘤细胞系B16F10，结果显示可显著抑制肺转移结节的数量[23]。以上结果提示Podoplanin与CLEC2相互作用，有助于循环肿瘤细胞在血流中的存活和/或粘附。

2.2.2 Podoplanin-CLEC2促进肿瘤淋巴道转移 Podoplanin-CLEC2在淋巴管发育中起着重要的作用，还可促进肿瘤细胞淋巴道转移[25]。最新研究发现，相比于脂溢性皮炎而言，Podoplanin在非黑色素瘤皮肤癌(包括基底细胞癌和鳞状细胞癌)中的表达水平明显上调。其在非黑色素瘤皮肤癌中的表达水平与淋巴管密度、淋巴结转移的数量呈正相关[26]。比利时癌症中心的研究表明，抑制Podoplanin表达可降低小鼠乳腺癌的转移，认为Podoplanin可作为乳腺癌患者潜在的预后指标[25]。同样在肺鳞癌中研究证实，Podoplanin表达水平与肺癌淋巴结转移及预后不良有显著相关性[27]。然而，Podoplanin在宫颈癌中的作用是独特的。研究证实，相比于对照组，Podoplanin阳性表达的宫颈癌患者存活率更高[12]。以上结果表明，Podoplanin有望成为评估部分恶性肿瘤预后的独立预测因子，其有望成为肿瘤治疗的新靶点。

2.3 Podoplanin-CLEC2促进癌症相关血栓形成

Podoplanin-CLEC2诱导的血小板聚集作用可能并不局限于肿瘤恶性进展。Königsbrügge等[28]应用前瞻性的“维也纳癌症和血栓形成研究(CATS)”队列，对200多名原发性脑肿瘤患者(大部分为高级别胶质瘤)进行随访研究。研究的主要终点是VTE的发生，目的是确定恶性肿瘤患者发生高VTE风险。结果显示，约14%的原发性脑肿瘤患者出现了客观证实的VTE。Riedl等[17]用免疫组化方法对脑瘤标本中Podoplanin的表达水平和血小板聚集情况进行研究。结果显示Podoplanin的过度表达与肿瘤内血栓形成和VTE风险的增加密切相关。此外，表达Podoplanin的脑瘤患者血小板计数降低，血浆D-二聚体水平升高。这些数据表明Podoplanin上调可能诱发患者血液高凝状态，从而可能触发VTE。Podoplanin-CLEC2相互作用在癌症相关血栓形成中起着重要作用。

Shirai等[23]在荷瘤小鼠模型中观察到，接种了Podoplanin阳性的B16F10细胞后，小鼠的背部皮肤中有大量血栓形成。抑制CLEC2表达后，小鼠血栓形成受到极大抑制，表明Podoplanin-CLEC2相互作用可刺激血小板活化，导致血栓形成。然而，由于Podoplanin也在正常组织中表达(包括肾足细胞、Ⅰ型肺泡细胞、淋巴管内皮细胞)，导致癌症相关血栓形成的Podoplanin可能并不局限于肿瘤细胞表面[29]。虽然这些细胞中的Podoplanin不能获得血小板CLEC2，然而，在病理状态下，可诱导异位Podoplanin表达。Payne等[30]报道了在静脉血栓形成过程中，Podoplanin在血管壁的表达上调，这可能是由血栓炎症引起的。此外，据报道，癌相关成纤维细胞表达Podoplanin，这与肺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌的恶性程度和不良预后相关[6]。这种病理表达的Podoplanin也可能通过与血小板CLEC2的相互作用参与癌相关血栓形成。

3 靶向Podoplanin-CLEC2在肿瘤治疗中的作用

3.1 抗血小板药物存在出血风险

由于Podoplanin-CLEC2活化血小板，在癌症相关血栓形成及肿瘤转移中发挥重要作用，抑制血小板可能成为有效靶点。血小板活化和聚集涉及多种机制，临床上常用的抗血小板药物是二磷酸腺苷P2Y12受体阻断剂，如氯吡格雷、普拉格雷。血小板活性也可通过抑制环氧化酶(如阿司匹林)或血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体(如阿昔单抗或替罗非班)而受到影响。先前的研究表明，阿司匹林在体外能够降低Podoplanin介导的血小板聚集[31]。根据血小板聚集增加癌症相关血栓形成的风险，ASCO指南推荐，低剂量阿司匹林或抗凝剂(如低分子肝素)可用于多发性骨髓瘤患者的一级血栓预防[32]。然而，与抗凝剂类似，阿司匹林和其他抗血小板药物也有出血的风险，这限制了它们的临床应用[33]。

3.2 CLEC2和Podoplanin作为药物靶点

阻断CLEC2和Podoplanin的靶向药物在临床前研究中已显示出作为抗癌药物的前景。理论上，这些药物可以减少肿瘤细胞转移、癌相关血栓形成。

人Podoplanin与CLEC2的结合依赖于其本身的PLAG3和PLAG4结构域。在此过程中，PLAG4结构域起主导作用。抗Podoplanin靶向药物正是根据这一原理研制，它能够识别Podoplanin的PLAG3或PLAG4的部分区域，以发挥效应[34]。研究证实，识别Podoplanin的PLAG3的单克隆抗体NZ-1对Podoplanin-CLEC2活化血小板具有抑制作用[35]。此结果在其他Podoplanin单抗(如P2-0和MS-1)也得到验证[34，36]。研究还发现Podoplanin表达被抑制后，血栓体积会明显缩小[30]。此外，在小鼠模型中研究证实，Podoplanin单抗与其他治疗手段联合治疗，能增强抗肿瘤疗效。Podoplanin单抗NZ-12和培美曲塞联合在治疗小鼠恶性胸膜间皮瘤中效果显著[37]。NZ-1联合近红外光免疫疗法，对恶性胸膜间皮瘤有显著的抗肿瘤作用[38]。大鼠-人嵌合抗体NZ-12可用于恶性胸膜间皮瘤放射免疫治疗，增强抗肿瘤作用[39]。这些证据有力地表明Podoplanin单抗具有良好的临床应用前景。然而，由于Podoplanin在正常组织中也有表达[29]，应注意其潜在的药物不良反应。为了解决这个问题，已经报道了特异性识别癌细胞上异常糖基化Podoplanin的LpMab单克隆抗体系列[40]。尽管该抗体很有希望避免副作用，但它可能无法识别慢性炎症期间内皮细胞、单核细胞中Podoplanin上调，会参与癌症相关的血栓形成。

研究还证实，CLEC2缺乏的小鼠在不增加出血的情况下发生VTE的风险显著降低[37]。且CLEC2缺乏的小鼠出血时间并无明显延长[41-42]。这表明血小板受体CLEC2在生理止血中的作用较小。同时考虑到CLEC2的表达高度局限于血小板和巨核细胞，故靶向CLEC2治疗可能具有优势。迄今为止，抗CLEC2抗体[23]、CLEC2结合小分子[43]和突变重组红细胞素[44]已被报道可与CLEC2结合，并阻止CLEC2与Podoplanin结合。但临床应用前仍需进一步研究。这些新的见解为癌症相关血栓形成及肿瘤转移的治疗和预防提供了新的策略。

4 小结与展望

部分癌细胞在其表面表达不同的Podoplanin。Podoplanin通过结合血小板受体CLEC2活化血小板，与肿瘤恶性进展、癌症相关血栓形成及预后不良有关。基于这些发现，Podoplanin和CLEC2可能是恶性肿瘤治疗的有吸引力的药物靶点。然而，Podoplanin在正常组织中广泛表达[29]。因此，需要进一步的研究来探索Podoplanin及CLEC2靶向药物在体内的潜在毒性和优势。