微环境调控在糖尿病肾病肾小管间质纤维化过程中的作用

罗莹莹，王小琴，邓丹芳，孙龙，林腊梅

(1.湖北中医药大学中医临床学院，武汉430061;2.湖北省中医院 湖北省中医药研究院 湖北中医药大学附属医院肾病科，武汉430074)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性并发症，2017年全球DN造成的伤残调整寿命年损失为1 100万人年，是慢性肾病伤残调整寿命年损失的首要原因［1］。DN也是发达国家终末期肾病和我国慢性肾病的主要病因，占我国慢性肾病发病原因的26.96%［2］。

既往一般认为DN是一种肾小球疾病，但随着研究的深入认为，与肾小球损伤相比，肾小管病变和肾间质纤维化可作为相对独立的发病机制用来预测肾脏疾病进展。肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是DN的重要特征，轻度的TIF足以增加肾小球损伤的易感性，形成肾小管损伤——肾小球损伤的恶性循环［3］。TIF主要以间质胶原沉积、炎症细胞浸润、肾小管细胞损伤丢失、成纤维细胞积聚和管周微血管稀疏为特征［4］。研究TIF相关调控机制，及时有效地干预致病靶点，对治疗DN至关重要。TIF通常呈局灶性阶段性分布，提示局部组织微环境可能在TIF发生发展过程中发挥重要作用［5－6］。但目前TIF的具体发生、发展机制仍不清楚。为更好地探究微环境影响DN TIF发生、发展的可能作用机制，现就DN中局部炎症、代谢紊乱、肾脏微血管等肾小管周围微环境及上皮－间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)对DN TIF进程的影响进行综述，为DN的预防与治疗提供新思路。

1 肾脏损伤与促纤维化微环境的形成

1.1 TIF诱导期炎症微环境的形成 长期高血糖状态诱导间质损伤和炎症细胞浸润，在损伤组织自我修复过程中，免疫细胞能够合成多种促纤维化的细胞因子，免疫炎症微环境持续存在使得这种修复过程成为进行性肾间质纤维化的中心驱动因素［7］。糖尿病状态下肾小管间质炎症细胞浸润，激活的巨噬细胞与树突状细胞、T淋巴细胞及活化的肾脏固有细胞共同参与调节适应性免疫，持续的细胞因子压力和多余炎症细胞的积聚是促进DN肾小管间质损伤和TIF的主要效应器［8－10］。

DN中巨噬细胞浸润促进TIF的进展［11］。在损伤的初始阶段，主要由γ干扰素和脂多糖诱导M1型巨噬细胞浸润，进而参与组织炎症反应;当损伤持续存在时，不断聚集的脂多糖可通过激活核因子κB，促进其下游一系列炎症介质释放，过度释放的炎症因子进一步激活核因子κB形成正反馈环放大效应，引发肾脏组织损伤的“瀑布效应”。随着疾病的进展，巨噬细胞在白细胞介素－4和白细胞介素－13的诱导下转变为M2表型，分泌白细胞介素－10等抗炎介质，抑制肾脏炎症反应进入组织修复阶段［12－13］。M2型巨噬细胞合成并释放转化生长因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子受体等影响纤维形成的产物，形成局部纤维化微环境，抑制肾小管上皮细胞(tubular epithelial cell，TEC)和间质微血管内皮细胞的生长，刺激淋巴细胞趋化并诱导成纤维细胞的募集和增殖［14－16］。骨髓来源的巨噬细胞为肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)的前体细胞之一，在肾脏损伤局部微环境中经历巨噬细胞－MyoF转化，可直接参与肾小管间质细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成［17］。此外，TEC损伤后修复性M2型巨噬细胞浸润产生的基质金属蛋白酶9可使肾脏基底膜屏障降解，并通过Wnt/β联蛋白途径参与TEC的EMT过程。有研究发现，抑制M2型巨噬细胞浸润可减少间质成纤维细胞的活化及ECM的沉积［18－19］。

树突状细胞广泛存在于肾小管间质中，可通过激活抗原特异性T淋巴细胞触发适应性免疫应答，从而启动DN中的组织损伤和修复。研究发现，阿托伐他汀可通过抑制P－选择素的表达和树突状细胞迁移抑制肾小管间质损伤［20］;而抑制CD103+树突状细胞介导的CD8+T细胞反应可减轻DN大鼠肾功能损伤及纤维化［21］。大量研究显示，发生炎症和纤维化的肾脏组织均有明显的T淋巴细胞浸润，T细胞激活后产生趋化因子和细胞因子，诱导单核细胞募集从而增强炎症反应;此外，T细胞产生的TGF－β1在慢性肾功能不全时可通过EMT途径调节成纤维细胞的分化，进而促进MyoF积累，影响TIF进展［22－25］。Tapmeier等［26］研究发现，耗竭单侧输尿管梗阻小鼠模型CD4+T细胞或淋巴细胞缺陷RAG－/－小鼠的肾脏纤维化程度减轻;用CD4+T细胞重建RAG－/－小鼠可恢复单侧输尿管梗阻模型诱导的肾纤维化严重程度，表明CD4+T细胞在肾纤维化中起关键作用。

由此可见，DN作为一种微血管病变，在病变早期即出现以炎症细胞浸润和纤维化为特征的肾小管间质病变，这种变化导致肾小球高压及滤过率的降低。M2型巨噬细胞被认为具有“肿瘤相关巨噬细胞”的功能，在一定程度上影响组织从炎症修复向“炎－癌”的转化。探索实现巨噬细胞M2到M1型转化的机制和药物，将有助于早期控制纤维化肾病。

1.2 代谢微环境与肾小管间质损伤 肾脏的代谢活动需要高氧的支持，一氧化氮(nitric oxide，NO)通过舒张血管增加肾血流量和氧气释放，是肾脏微血管内氧供应和消耗的主要调节因子［27］。DN中NO代谢紊乱，除1型DN早期NO合成升高外，DN中NO的代谢通常受损。高血糖本身和(或)晚期糖基化终末产物都可通过抑制肾内皮一氧化氮合酶减少NO的产生［28－29］。微血管系统损伤、氧弥散降低以及肾脏细胞代谢异常等造成缺氧状态，缺氧继而可对TEC、间质炎症细胞、内皮细胞等细胞的代谢产生深远影响［27］。缺氧诱导因子(hypoxia－inducible factor，HIF)是调控氧稳态的关键转录因子，在缺氧条件下，HIF－α无法被降解而与HIF－β结合为稳定的二聚体，随后进入细胞核中并诱导下游血管内皮生长因子、金属蛋白酶组织抑制物、结缔组织生长因子等一系列靶基因的转录，从而对血管生成、细胞增殖和肾间质过量ECM的沉积产生重要影响［30］。糖尿病低氧环境下，HIF－1α的高表达可致p53上调，导致TEC在G2/M期停滞，并激活TGF－β和结缔组织生长因子介导的纤维化信号通路，导致ECM生成和TIF的发生［31］。在慢性肾病小鼠模型中，缺氧可上调与肾小管细胞HIF－1α激活相关的血管内皮生长因子、纤维连接蛋白和1型胶原蛋白的表达，明显加重肾纤维化［32］。

研究表明，抑制高糖/缺氧诱导的HIF－1α积累，可有效阻断TEC的EMT过程，从而减轻DN小鼠的TIF进展［33］。高糖可以诱导活性氧类的产生，使肾小管细胞出现氧化应激特征。在慢性高血糖环境中，TEC合成活性氧类产物和趋化因子等炎症介质，经自分泌或旁分泌途径透过紧密连接屏障进入肾间质，造成细胞DNA损伤、脂质过氧化等参与肾间质损伤［34－35］。有研究发现，DN小鼠的肾小管中积累了过量的晚期氧化蛋白产物，可引起肾小管的线粒体功能障碍和氧化应激，并通过蛋白激酶C信号通路和CD36受体途径加重早期DN的TIF［36－37］。通过减少氧化物生成和蛋白质氧化，改变受损肾小管细胞的氧化还原能力，减少活性氧类的产生来源，可有效改善DN模型氧化应激所致的肾小管间质损伤和TIF［38］。

脂肪酸氧化是近端小管细胞代谢的首选能源。肾小管细胞线粒体的氧化损伤和功能障碍可导致DN肾脏循环中脂肪酸的摄入与消耗失衡。糖尿病模型小鼠肾TEC内的脂质积聚具有细胞毒性，是导致肾小管萎缩的发病机制之一。有研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体是调节脂肪酸摄取和氧化的关键转录因子，过氧化物酶体增殖物激活受体γ途径异常可引起肾小管细胞脂质代谢紊乱，导致肾小管扩张、TIF和肾功能受损［39］。在DN中，炎症和纤维化信号通路被激活，肾小管补体C5a水平升高，C5a/C5aR信号通路激活影响肾小管细胞脂质代谢，并通过磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B通路驱动肾小管细胞TGF－β的分泌;经C5a抑制剂治疗糖尿病小鼠肾脏中脂质积聚减少，肾小管间质损伤和纤维化亦有所减轻［8］。

DN的核心是代谢紊乱，糖代谢异常影响氧和脂质等其他代谢的调控，局部代谢环境的失调引发糖尿病肾脏微炎症，并诱导肾小管间质损伤和纤维化发生。

1.3 肾小管周围血管微环境改变 肾脏微血管功能障碍既是糖尿病间质缺氧损伤的结果，又是创造缺氧微环境、加速TIF反应的必要因素［40］。肾小管周围毛细血管内皮细胞是DN高糖缺氧损伤的重要靶点，具有向间充质细胞转化的能力。暴露于DN缺氧微环境中的微血管内皮细胞，可激活TGF－β途径诱导的内皮细胞间充质转化反应，其内皮细胞的特异性表型标志物下调并转化为成纤维细胞，造成微血管内皮功能紊乱及管周毛细血管稀疏，从而加剧肾小管间质缺氧损伤及TIF的病理过程［41］。

血管周细胞位于内皮细胞基底侧，是构成肾间质微血管和组织间隙屏障的一部分，与内皮细胞共同维持肾小管周围脉管系统的稳定。在糖尿病TIF发展过程中，周细胞不仅直接参与病理性血管收缩，并作为MyoF前体细胞之一，通过分化为MyoF而促进ECM的积累，促使间质纤维化瘢痕形成。周细胞具有维持毛细血管稳定性、完整性和通透性的作用，其缺乏可导致管周毛细血管稀疏，毛细血管氧气和营养物质的输送受损;内皮功能紊乱反过来加重肾小管间质损伤和肾小管萎缩，如此形成的恶性级联反应促进糖尿病TIF的快速形成［42－43］。

2 微环境促进间质纤维化形成

2.1 MyoF来源与肾小管EMT 在肾纤维化的发病机制中，尽管MyoF不是唯一能够分泌基质蛋白的细胞，但活化的MyoF通常被认为是产生基质的主要细胞［44］。肾脏MyoF的来源尚不清楚，目前认为MyoF来自肾周细胞、血管周围成纤维细胞或间充质干细胞样细胞以及骨髓来源细胞(巨噬细胞和纤维细胞)和内皮细胞［45］。而TEC通过EMT过程产生的MyoF占间质所有MyoF的比例尚存在争议。长期暴露于炎症和缺氧等微环境的TEC易受损而从细胞连接处释放出来，逐渐失去上皮特征及上皮细胞标志物并获得更多的间充质特征，迁移到肾小管外间质空间，最终活化为MyoF(即EMT)，大量ECM产生导致正常肾脏结构的破坏和肾功能的逐渐丧失［46］。有研究通过多种转基因小鼠模型观察到5%的肾脏MyoF来自经EMT的TEC［47］，而另有研究报道，约30%的MyoF来源于EMT［48］。

TEC的EMT主要依赖于EMT诱导转录因子的调控，EMT诱导转录因子可调节EMT各组成部分的表达［49］。长期的DN基础及临床研究发现，成纤维细胞生长因子－2作为促纤维化生长因子，可以诱导人TEC发生EMT，其特征表现为紧密连接和黏附连接的主要成分(ZO－1和E－cadherin)表达下调，TEC G2期阻滞并获得纤维化的分泌表型［50－51］。EMT的激活导致细胞极性丧失，细胞间连接破坏，管状基底膜降解以及细胞外基质重组，这一系列事件被称为纤维化的宿主修复反应［52］。

EMT被认为是上皮和间充质表型之间的一组多重动态过渡状态［53］。在EMT反应中，并非所有TEC都完成了向成纤维细胞表型的转化。损伤后的TEC具有间质特征，能够产生多种促纤维化因子和细胞因子，但仍附着在基底膜上，即“部分EMT”［54－57］。TEC转化为MyoF的中间状态反映了EMT转录驱动和抑制的微妙平衡。TEC的这种可塑性意味着EMT程序可能是一种可逆的细胞程序，它将上皮细胞暂时置于准间充质细胞状态，并且在可逆过程中恢复到上皮状态，而该细胞程序取决于特定的细胞环境以及细胞的生理或病理状态［58］。研究表明，在TEC没有完全转化为MyoF的情况下，部分EMT足以通过触发细胞周期停滞而导致TEC功能障碍，从而促进促纤维化细胞因子的分泌和纤维化［59－60］。关于损伤肾脏中MyoF的来源比例(EMT、内皮－间充质转化、固有成纤维细胞、周细胞等)仍有争议，但现已明确EMT所致的肾间质纤维化是DN的重要环节之一，而细胞EMT的机制还有待进一步研究。

2.2 MyoF活化微环境 肾纤维化病变在肾实质内并非均匀分布，通常起始于某些病灶部位［5－6］。这些部位通过特殊机制招募和富集可溶性促纤维化因子，激活并增殖间质成纤维细胞，进而产生大量的细胞外基质成分［61］。细胞黏合素C(tenascin－C，TNC)是一种外分泌型基质糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、迁移、黏附、凋亡等过程，可与多种促纤维化因子结合，如TGF－β1、血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子－2等［62］。TNC通过组织促纤维化微环境在MyoF激活中起重要作用。体外促纤维化因子音猬因子、TGF－β1、Wnt可刺激成纤维细胞表达TNC，而TNC可以选择性地促进肾间质成纤维细胞的增殖及增殖相关基因的表达;体内在单侧输尿管梗阻或缺血再灌注损伤肾脏中的TNC表达迅速增加，并主要定位于肾间质中富含成纤维细胞的部位［61］。另有研究发现，TNC可与Wnt配体结合并从周围环境中招募Wnt配体，随后将其呈递给邻近细胞［63］。由此可见，TNC是促进MyoF活化微环境的主要组成部分，TNC在TIF过程中作为“分子海绵”从周围微环境中募集促纤维化因子，其中包括TNC在内的基质细胞蛋白、纤维蛋白、糖蛋白、促纤维化因子(如TGF－β1、Wnt、音猬因子、肿瘤坏死因子－α)以及外泌体构成了MyoF活化和增殖微环境的主体［64］。这种微环境在介导TIF炎症细胞浸润、代谢紊乱、血管功能缺陷和TECs萎缩中起关键作用。

2.3 肾小管间质纤维化形成 在糖尿病肾脏炎症、代谢紊乱、肾小管周围血管微环境改变等一系列因素的交互作用下，多种类型固有肾脏细胞以及免疫细胞的参与共同导致DN间质纤维瘢痕形成及肾脏功能丧失。Janus激酶/信号转导及转录激活因子、TGF－β/Smad、Wnt/β联蛋白、环腺苷酸结合蛋白－Ras相关蛋白1等信号通路均参与调控EMT或ECM蛋白的表达，在TIF过程中起重要作用［65］，其中MyoF对TGF－β1非常敏感，TGF－β1是MyoF活化的主要调节因子［66］。

高血糖和晚期糖基化终末产物可导致肾脏细胞损伤死亡，通过模式识别受体引发炎症反应，募集单核细胞并分化为炎症巨噬细胞，驱动肾脏炎症微环境形成［7］;高糖缺氧等环境促使间质血管内皮细胞和周细胞向成纤维细胞分化，增加了成纤维细胞的数量，造成管周毛细血管稀疏及间质缺血缺氧。受损内皮细胞也可通过Notch和Wnt信号通路促进成纤维细胞的激活［67］。内皮功能紊乱加重了TEC凋亡和肾小管萎缩，受损TEC被阻滞在细胞周期的G2/M期，产生和分泌促纤维化细胞因子并进一步吸引炎症细胞进入肾小管间质，促使TEC向间充质表型转变［68－69］。在基质糖蛋白TNC的“组织”下，各种促纤维化细胞因子富集并形成恶性循环，促使各种来源MyoF的活化并增殖，产生大量ECM，最终促使间质纤维化瘢痕的形成［6，27，55，61，67］。

3 小 结

TIF是肾脏纤维形成并导致肾衰竭的关键，也是DN进展至终末期肾病的必经过程。糖尿病TIF的形成并非单一的过程，而是一个复杂的动态过程。间质性炎症反应是肾小管间质损伤自限性修复和进行性纤维化的始动因素。在炎症、代谢紊乱微环境下，肾小管周围微血管功能障碍，并可进一步加剧缺氧炎症微环境，在上述因素的共同作用下，包括TEC在内的多种细胞转分化为MyoF，形成恶性循环，最终导致肾小管萎缩和TIF。进一步阐明DN中TIF的具体过程和机制以及靶向调控DN不同微环境状态中相应的病理过程，有助于精准治疗并预防TIF或延缓DN进展。