DNA损伤修复与糖尿病及其并发症研究进展

陈诗梅，韦芳

(上海交通大学附属第一人民医院上海市第一人民医院眼科 国家眼部疾病临床医学研究中心 上海市眼底病重点实验室上海市眼视觉与光医学工程研究中心 上海市眼科疾病精准诊疗工程技术研究中心，上海200080)

糖尿病是一组以糖代谢异常为特征的全身代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷、胰岛素敏感性降低或两者共同作用导致;据2019年国际糖尿病联盟数据显示，全球有4.63亿成人糖尿病患者［1］，中国成人糖尿病患者数量高达1.14亿，占全球成人糖尿病患者总数的1/4以上，患病率高达35%左右，患者数量居世界第1位［2］。糖尿病易累及微血管及大血管病变，导致肾、眼、神经系统、心血管系统等的并发症，是糖尿病患者致死致残的主要原因。2013年全球因糖尿病及其并发症死亡人数约510万，糖尿病相关医疗保健支出达到5 480亿美元，造成严重的社会及经济负担［3］。

高血糖与活性氧类(reactive oxygen species，ROS)相关氧化应激在碱基、核苷酸、单链和双链等水平导致DNA损伤，产生大量DNA损伤标志物8－羟基鸟嘌呤和8－羟基脱氧鸟嘌呤，在糖尿病大鼠的组织和血浆中均有发现［4］。糖尿病高ROS致细胞核DNA损伤，伴随DNA修复酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(ADP－ribose)polymerase，PARP］的过度激活，两者不仅降低沉默信息调节因子(silence information regulator，SIRT)、过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1和AMP活化蛋白激酶(adenosine monophosphate－activated protein kinase，AMPK)等活性，引起线粒体生物合成减少，还进一步加剧了糖脂代谢的异常［5］。研究表明，氧化应激统一机制学说在糖尿病心肌病、心脏电活动传导、心血管意外事件以及微血管病变的发病中占据核心地位［5－6］。因此，DNA损伤修复作为糖尿病并发症统一机制学说的上游致病环节受到广泛关注。现就糖尿病与其氧化应激造成的DNA损伤修复之间的研究进展予以综述。

1 高血糖下氧化应激与DNA损伤

糖尿病并发症源于高血糖诱导的细胞损伤的统一机制:β细胞功能障碍引起的异常代谢状态与其他因素(对损伤的遗传易感性、环境因素等)的相互作用，伴有氧化应激和ROS产生［7］，即细胞长期暴露于高血糖的环境，引起线粒体产生更高水平的ROS［8］。ROS引起胰岛β细胞损伤，破坏线粒体结构，诱导细胞凋亡，核因子κB信号通路，引起炎症反应，抑制胰十二指肠同源盒因子1的核质易位和能量代谢，减少胰岛素合成与分泌［9－10］;另一方面，ROS可引起核DNA链的断裂，从而激活PARP。PARP是存在于多数真核细胞中的多功能蛋白质翻译后修饰酶，通过识别结构损伤的DNA片段而被激活，被认为是DNA损伤信号中最早被激活的蛋白质之一;PARP1是主要协同修复蛋白，与DNA损伤位点结合后被激活，通过调节底物和自身活性产生多聚ADP核糖链，在DNA损伤部位周围发生聚ADP核糖基化，以修饰其他蛋白质，包括组蛋白和染色质重塑酶，从而促进DNA修复因子的招募［11］。在高血糖环境下，为了维持基因组的稳定性，各种靶器官和靶细胞均存在PARP的过度激活，其所导致的负性效应包括:①细胞内NAD+大量消耗，胰岛素受体磷酸化水平显著下降，同时烟酰胺单核苷酸腺嘌呤转移酶1、SIRT和AMPK下调，细胞内抗氧化剂大量消耗，导致细胞处于氧化与抗氧化失衡的应激状态，加速细胞凋亡;②PARP可修饰葡萄糖糖酵解途径中的甘油醛－3磷酸脱氢酶，从而降低其活性，导致其上游代谢产物淤积并进入以下旁路:a.多元醇通路活性增高;b.晚期糖基化终末产物形成增多;c.蛋白激酶C激活;d.己糖胺通路活性增高，上述4种通路的激活均导致慢性炎症过程［12］，通过诱导转录因子、基因转录以及表观遗传修饰导致靶器官或组织中的细胞肥大、增殖、重塑和凋亡信号转导，在生理学上表现为冠状动脉疾病、外周动脉疾病、视网膜病变、神经病变和肾脏微血管损害等一系列糖尿病并发症。

ROS在碱基、核苷酸、单链和双链等水平损伤DNA。氧化应激时，DNA损伤加重炎症反应，细胞再生能力下降、代谢受损以及内分泌系统功能受到抑制，继而破坏全身代谢稳态，引发糖尿病。ROS可引起DNA损伤，而DNA损伤也可诱导ROS产生，两者相互作用形成恶性循环，加重了糖尿病并发症的发生。

为维持内环境的稳定，细胞积极通过DNA修复来避免有害的基因组不稳定性，包括碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复、同源重组和非同源末端连接［13－14］。其中，p53、SIRT、PARP、共济失调性毛细血管扩张症突变基因(ataxia telangiectasia mutated，ATM)等重要的调控分子同时参与DNA修复和细胞内物质代谢过程，并在上述过程中发挥汇聚点作用［15－16］，其可能成为调节高血糖下氧化应激所致DNA损伤反应、阻断糖尿病代谢异常及血管功能障碍的关键靶点。

2 DNA损伤修复相关机制

DNA损伤时，传感器至各种效应分子之间的信息传递使信号放大，引起多条细胞通路激活，其中ATM蛋白以及磷脂酰肌醇－3－激酶β是重要的调节蛋白。持续高糖暴露条件下，DNA修复受损导致了糖尿病的发生。

ATM是一种高分子量(350 000)蛋白激酶，是磷脂酰肌醇－3－激酶家族的成员，其他家族成员包括DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(catalytic sunbunit of the DNA－dependent protein kinase，DNA－PKcs)、共济失调－毛细血管扩张相关蛋白与Rad3相关(Rad3－related，ATR)蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/雷帕霉素相关蛋白等［17］。ATM－细胞周期监测点激酶(checkpoint kinase，Chk)2和ATR－Chk1是经典的检查点通路起始，能够协调DNA修复过程和细胞周期进程［18］。

MRN(Mre11－Rad50－Nbs1)复合物与DNA双链断裂(double strand break，DSB)点结合时，ATM作为传感器被激活。ATM被招募时，磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)聚集在损伤部位，从而协调与DNA双链断裂修复相关的下游因子［19］。γH2AX已成为监测DNA损伤起始或终止的具有高度特异性和敏感性的分子标记［20］。

当DNA双链受损时，暴露的单链DNA被结合复制蛋白A覆盖，招募并激活ATR/Chk1复制检查点。Chk1的有效活化和下游磷酸化依赖于介质蛋白DNA拓扑异构酶Ⅱ结合蛋白1和Claspin的作用。DNA拓扑异构酶Ⅱ结合蛋白1通过9－1－1复合物招募单链DNA－复制蛋白A，进而激活ATR激酶［21］;而Claspin可结合Chk1并作为ATR介导的磷酸化和活化的平台［22］。

DNA受损时，ATM磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶2，使细胞分裂周期蛋白(cell－division－cycle protein，Cdc)25A磷酸酶失活，导致细胞周期蛋白依赖性激酶2持续磷酸化，从而阻滞G1～S期;ATM磷酸化乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)、范可尼贫血互补群基因D2、Nbs1、染色体结构维持蛋白1上的丝氨酸位点，以引起S期阻滞。Cdc25C(一种双特异性蛋白磷酸酶)使Cdc2自由形成Cdc2－细胞周期蛋白B复合物。若G2期发生DNA损伤，Cdc25C被泛素化降解，从而激活p53依赖性途径，以停滞细胞周期。BRCA1也介导G2～M期阻滞。BRCA1通过BRCT结构域与CtIP相互作用，催化CtIP的泛素化;DNA损伤后，CtIP的泛素化形式与染色质相互作用，并参与G2～M检查点［23］。

Chk1和Chk2将DNA损伤修复与细胞周期联系起来，Chk2可诱导下游p53发生磷酸化并激活一系列修复分子，p53是一种肿瘤抑制基因，也是DNA损伤修复相关蛋白，决定着细胞衰老、凋亡或肿瘤发生。由DNA损伤诱导的G1～S/S/G2～M期检查点的终点均通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性阻滞细胞周期，以为启动DNA修复争取更长的时间;参与细胞周期停滞的蛋白质的激活可诱导DNA修复和凋亡相关基因。

3 DNA修复对糖尿病及其并发症的影响

BER利用DNA糖基化酶去除DNA损伤，特异性切除受损核苷酸上的N－β－糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，称AP位点。AP核酸内切酶将受损核苷酸的糖苷－磷酸键切开并移去小片段DNA，由DNA聚合酶Ⅰ合成新的片段。一般哺乳动物核苷酸切除修复途径可去除DNA螺旋扭曲的大体积DNA损伤，而小体积损伤则通过BER进行修复。为了维持基因组的完整性，核内存在多种修复途径，BER途径是修复受损线粒体DNA的主要途径［24］。受损线粒体DNA的累积可能导致线粒体功能障碍和疾病，如老化相关的退行性疾病、恶性肿瘤［25］。糖尿病的病理生理过程与线粒体代谢功能相互干扰，糖尿病导致线粒体DNA突变、线粒体密度及其ATP产量下降、线粒体信使RNA水平降低，导致氧化应激产物增加;当上述线粒体改变发生在胰腺时，可引发2型糖尿病的胰岛素抵抗;若上述线粒体改变发生在对氧化损伤高度敏感的内皮细胞，可引发继发性血管疾病，并引起心脏、肾脏、眼部和神经系统并发症［26－27］。

DNA依赖性蛋白激酶(DNA－dependent protein kinase，DNA－PK)是非同源末端连接的关键蛋白分子。DNA－PKcs的主要作用是介导DNA－PK的催化，Ku蛋白与双链DNA的断端连接，促进双链断裂的重接。Ku蛋白招募Artemis，DNA－PKcs结合到DNA末端并磷酸化Artemis。Artemis使DNA－PKcs与Ku－DNA复合体分离，随后与X线修复交叉互补基因4共同形成连接酶Ⅳ－X线修复交叉互补基因4－XRCC4类似因子复合物，起到类似支架的作用，完成DNA修复［28］。DNA－PK是DSB的核心参与者，其在代谢调节中显示出新的作用，Park等［28］对DNA－PK负性调节AMPK分子机制的研究发现，DNA－PK抑制剂可通过激活多个AMPK靶点保护机体免受肥胖和2型糖尿病的影响。持续的DNA损伤信号不仅通过基因突变导致细胞衰老和功能下降，还可导致代谢失调，因此可通过消除衰老细胞或单独抑制DNA－PK或改善DNA修复策略来调节持续DNA损伤的有害作用。

在同源重组中，MRN复合物对DNA双链断裂的修复和信号转导至关重要［29］。Mre11与CtIP共同启动切除过程，CtIp丝氨酸－327磷酸化作为细胞进入S期和BRCA1募集功能的分子开关，可同时促进单链DNA末端切除。Rad51－单链DNA联会前核蛋白纤维介导同源序列的寻找和DNA链侵入，是HR修复的核心反应;修复过程以3＇端为引物进行DNA合成，使Rad51与双链DNA分离;此外，Rad50、Rad51和γH2AX的募集过程也依赖BRCA1［30］。二甲双胍可通过刺激同源末端连接、同源重组和核苷酸切除修复途径中的DNA损伤反应减少DNA损伤，维持基因组稳定性［31］。

4 DNA损伤修复相关蛋白与糖尿病

许多调控蛋白可同时影响DNA损伤修复与细胞内物质代谢。缺乏ATM细胞的氧化应激增加，抗氧化反应低下，对氧化剂处理敏感［32］;ATM对肿瘤抑制因子p53、AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和缺氧诱导因子－1均有作用，表明ATM具有调节线粒体功能及控制代谢的作用［33］。Claudia等［34］研究发现，ATM通过调节磷酸戊糖途径促进抗氧化反应。葡萄糖－6－磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的限制酶，可产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(一种必需的抗氧化辅助因子)，激活ATM可诱导葡萄糖－6－磷酸脱氢酶的活性，依赖ATM的磷酸戊糖途径使核苷酸产生增加，进而导致葡萄糖－6－磷酸脱氢酶缺陷细胞的DSB修复能力受损，即ATM通过刺激还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成和促进修复DSB所需的核苷酸合成来保护细胞免受ROS积累的影响。Armata等［35］证实，调控胰岛素抵抗的ATM通路是由p53磷酸化介导，同时也是葡萄糖稳态生理调控的重要机制。

共济失调是一种由ATM蛋白缺失引起的单基因常染色体隐性遗传性疾病。共济失调患者的2型糖尿病发病率较高，表现为胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受等典型症状［36］。葡萄糖转运蛋白4负责胰岛素介导的骨骼肌葡萄糖摄取，而ATM的失活可抑制葡萄糖转运蛋白4功能，影响胰岛素信号的转导［37］。二甲双胍是2型糖尿病的一线治疗药物，而ATM的变异可改变二甲双胍对血糖的反应［38］。综上，ATM基因与DNA损伤修复、细胞周期进程相关，并与糖尿病发生发展紧密联系，可作为治疗糖尿病及其并发症的新靶点。

p53是细胞周期和细胞凋亡的关键调节因子，决定了细胞衰老、凋亡或肿瘤的发生。p53及其家族成员p63和p73参与了细胞代谢的许多方面，包括AMPK和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号转导、碳水化合物和脂质代谢、自噬的调节以及线粒体完整性和氧化还原平衡的维持［39］。研究发现，Δ40p53(一种p53突变体，缺少部分激活域)小鼠表现为葡萄糖不耐受、低胰岛素血症以及β细胞质量和增殖缺陷，表明p53在β细胞增殖调节中起作用，可影响年龄依赖性糖尿病的发展［40］。

SIRT作为一种NAD+依赖性酶，是各种代谢途径的重要调节因子。SIRT1在DNA修复中起关键作用，大多数SIRT1缺陷小鼠胚胎的死亡原因为DNA损伤和染色体异常［41］。SIRT1和SIRT6缺陷细胞修复DNA双链断裂的能力下降;SIRT6通过整合DNA修复和应激信号通路调节DNA修复［42］。SIRT可通过与同源重组修复、非同源末端修复、核苷酸切除修复等途径中的核心蛋白质p53/叉头框转录因子O/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1/核因子κB/Ku70等相互作用参与修复DSB等DNA损伤，从而在维持基因组稳定性、寿命以及细胞能量代谢调节等一系列生物学作用中发挥至关重要的作用。

高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一种高度保守的核蛋白，在胞核中主要与DNA结合并作为核因子参与损伤修复。当组织受到一定损伤(高糖、高血脂等)代谢异常信号刺激后，HMGB1转移释放至胞质并发挥炎症细胞因子的作用。HMGB1与糖尿病的某些慢性并发症紧密相关。Abu El－Asrar等［43］发现，糖尿病大鼠和小鼠的视网膜HMGB1显著上调，且玻璃体内注射HMGB1可诱导正常大鼠视网膜的炎症信号通路，提高视网膜通透性。另有研究显示，HMGB1与不同受体(Toll样受体2、Toll样受体4、晚期糖基化终产物等)结合引发的相关炎症通路激活均与糖尿病心肌病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变相关［44－45］。

PARP蛋白是DNA的损伤感受器，在不同情况下，PARP蛋白可调节DNA损伤和代谢能力。PARP抑制剂可促进糖尿病患者的创面愈合，还可通过降低炎症、氧化应激、纤维化水平等改善糖尿病肾病的进展［46－48］。

8－羟基脱氧鸟苷是DNA氧化损伤的标志物，糖尿病患者心脏中8－羟基脱氧鸟苷水平升高、线粒体DNA损伤增加［49］。人MutT同源物1、人类8－羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶和人类MutY DNA糖基化酶是构成8－羟基脱氧鸟苷修复通路的重要元件，其基因多态性变异与2型糖尿病密切相关［50］。此外，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与2型糖尿病大血管病变也具有相关性［51］。

高糖环境下ROS及代谢的变化导致DNA损伤，造成基因组不稳定，而DNA损伤修复进一步影响代谢;DNA损伤修复相关蛋白与代谢调节的联系有待进一步研究，随着研究的不断深入，将有更多上述两条途径相关的蛋白质被发现。

5 小 结

DNA氧化损伤在糖尿病并发症的统一发病机制中占据重要地位，深入揭示和阐明其确切的分子机制有重要意义。糖尿病代谢紊乱所致的DNA氧化应激损伤具有明显的特征，但其具体分子机制尚未明确。DNA修复与细胞代谢息息相关，兼具DNA损伤修复和细胞代谢调控双重功能的蛋白分子的突变或失活在体内外水平均可导致糖代谢或糖耐量的异常，研究此类蛋白在上述两种功能间达到平衡的机制有望为糖尿病及其并发症的预防和治疗提供新方法。