人激肽释放酶相关肽酶在卵巢癌中的研究进展

何征秦，王雪，蔡雪，张广美

(哈尔滨医科大学附属第一医院妇产科，哈尔滨 150001)

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一。据美国癌症协会统计显示，2019年卵巢恶性肿瘤发病人数为22 530例，死亡人数达13 980例，死亡率居女性常见恶性肿瘤的第4位[1]。鉴于早期卵巢癌患者的预后优于晚期患者，故针对卵巢癌的高危因素采取预防措施、早期检测、评估预后以及监测复发有助于减少卵巢恶性肿瘤的发生，提高卵巢癌患者的生存率[2]。人激肽释放酶相关肽酶(kallikrein-related peptidase，KLK)由15种高度保守的丝氨酸蛋白酶组成，广泛存在于生物体液和组织中，具有不同的生物学功能[3]。KLK3作为筛查前列腺癌的生物标志物而广为人知，而其他KLK及其在正常生理和疾病中的作用了解较少。近年来随着研究的深入，KLK家族作为潜在的生物标志物被人们广泛关注。KLK与不同的恶性肿瘤相关，有可能是肿瘤的生物标志物。研究显示，在信使RNA(message RNA，mRNA)和(或)蛋白水平上，多种KLK在卵巢癌中过表达，并与卵巢癌的进展密切相关[4-5]。现就KLK在卵巢癌中的研究进展进行综述，以期为建立以KLK为基础的多参数卵巢癌肿瘤标志物体系提供新思路。

1 KLK概述

20世纪30年代，Kraut等[6]将在胰腺提取物中发现的血管活性十肽激肽命名为胰腺组织KLK。到20世纪90年代初，仅有3个KLK基因家族成员被发现，即KLK1、KLK2和KLK3，随后其他的KLK基因陆续被发现[3]。人KLK基因家族定位于染色体19q13.4上，包括15个编码丝氨酸蛋白酶的基因，是目前已知的最大的丝氨酸蛋白酶基因簇，其在DNA和氨基酸水平上显示出显著的同源性[3]。

1.1KLK的分类和分布 根据KLK在体内的分布可分为血浆KLK和组织KLK(包括KLK1～15)，两者在分子量、底物特异性、免疫学特性、基因结构以及释放的激肽亚型等方面有显著差异。血浆KLK是首个发现的从高分子量激肽原中释放激肽的酶，其结构特征与其他KLK有很大不同。KLK1～15在多种组织和器官中表达，包括皮肤、中枢神经系统、胰腺、乳腺、前列腺、肾脏等，其中KLK1、KLK5～8和KLK10～13在正常人皮肤的角质层、颗粒上层以及相关的皮脂腺、汗腺、毛囊和神经组织中表达水平稍高，KLK2、KLK3和KLK4主要在前列腺表达[7]。

1.2KLK的表达 人类组织KLK家族编码了15个同源性分泌型丝氨酸蛋白酶，其蛋白水解活性不同，其中KLK3、KLK7和KLK9显示糜蛋白酶样活性，KLK1、KLK10～11和KLK4具有糜蛋白酶和胰蛋白酶样活性，而其他KLK具有胰蛋白酶样活性[8]。在某些特定情况下，多种KLK可形成一个组织特异性的蛋白水解网络，参与机体重要的生理病理过程。

KLK的表达在多个水平上受到调控，包括转录和翻译水平。其中，在转录水平受到类固醇激素和KLK启动子的表观遗传修饰调控[9]。微RNA(microRNA，miRNA)参与KLK的转录后调控，也可作为KLK的下游效应器[10]。除转录调控外，前体KLK的不可逆激活也受到严格的调控，蛋白水解活性的不当增加可能会导致细胞内稳态的丧失，导致一系列疾病的发生发展[11]。

有些KLK基因在不同组织中由不同激素调节，如在前列腺癌细胞系中KLK4基因的上调受雄激素调节，在乳腺癌细胞系中受雄激素和孕激素调节，而在子宫内膜癌细胞中主要受雌激素调节[12]。KLK在不同组织中的差异表达模式和在同一组织中不同亚型的平行表达模式提示KLK之间可能存在多种相互作用。KLK10在大肠癌细胞系中表达上调，当沉默KLK10后可能抑制癌细胞生长和糖酵解，从而延缓大肠癌的进展[13]；而乳腺癌组织中KLK10的表达呈下调状态，并可能与雄激素受体相关[14]。在卵巢癌中可以观察到KLK5～8、KLK10和KLK11的强表达，KLK1、KLK13和KLK14的中等表达，KLK家族的其他成员在卵巢癌中弱表达。虽然弱表达，但仍可能发挥重要的调节作用，如激活信号分子过程[3]。

1.3KLK的生物功能 所有KLK均是单结构域蛋白，以不活跃的酶原形式分泌，通过去除较短的前肽被蛋白水解激活[15]。一些KLK在体外激活其他前体KLK，而另一些则具有自我切割的能力，还有一些受其他蛋白酶(如基质金属蛋白酶)的切割[16]。作为蛋白酶，KLK通过激活细胞膜上的蛋白酶活化受体触发细胞内信号通路，并通过与补体C3的级联反应在先天性免疫中发挥作用，KLK的失调与炎症疾病相关[16]。KLK可通过自身的酶活性调节必要的生理功能，如免疫功能、皮肤脱屑、牙釉质形成以及精液液化等。此外，KLK还可调节生长因子的生物利用度，激活蛋白酶活化受体，促进细胞增殖，降解细胞外基质成分[17]。

KLK还通过激活与肿瘤相关的蛋白分解过程参与肿瘤的发生。如KLK通过促进上皮-间充质转化促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[18-19]。KLK也可通过调节肿瘤微环境中多种细胞间的相互作用，促进血管生成和其他促肿瘤过程[20]。KLK在不同组织中的表达失调与多种疾病的发生相关，故通过调控KLK在不同疾病中的表达，可能是治疗相关疾病的潜在靶标[21]。

2 KLK与卵巢癌

在某些肿瘤或非肿瘤疾病中，KLK在转录水平和蛋白质水平上均协调性地上调或下调，提示KLK存在共同的调控途径。由于KLK基因表达失调与癌症或其他疾病有关，有研究将KLK基因的差异表达特点与作为癌症潜在生物标志物联系起来。研究显示，KLK在癌症的筛查、诊断、预后、肿瘤分期、监测治疗的药理反应性以及评估肿瘤复发或缓解等方面均具有一定意义[22]。大部分KLK(包括KLK2～11、KLK13～15)在卵巢癌细胞中处于表达失调状态[23]，其中KLK4、KLK5、KLK10、KLK15可作为卵巢癌预后不良的指标，而KLK8、KLK14、KLK13可作为卵巢癌预后良好的标志物，KLK8、KLK11、KLK14具有早期诊断卵巢癌的能力，KLK4还可作为预测紫杉醇耐药的指标[24]。另有研究表明，除糖类抗原125外，KLK6、KLK13可能在卵巢癌的早期检测中起关键作用[25]。

2.1KLK与卵巢癌肿瘤微环境 肿瘤微环境中的细胞和细胞衍生元素(包括细胞外基质、蛋白、细胞因子、生长因子、激素和蛋白酶)为KLK提供了丰富的底物来源，进而促进疾病进展，调控化疗耐药的关键机制[26]。在器官特异性肿瘤微环境中，KLK发挥肿瘤生物学作用并调节细胞之间的相互作用[27]。此外，KLK蛋白水解网络在卵巢组织和卵巢癌肿瘤微环境中也起着至关重要的作用。一些KLK水平的升高可能会增加细胞外基质的降解、卵巢癌细胞的侵袭和转移；另一些KLK调节细胞的增殖和血管生成。相反，KLK亦可抑制血管生成，产生肿瘤抑制作用[28]。KLK3又称前列腺特异性抗原，其可强烈激活胰蛋白酶和颗粒酶B，导致细胞外基质损伤，从而诱导前列腺癌细胞体外死亡[29]。但对于KLK在肿瘤微环境中受肿瘤部位的细胞因子、炎症介质和生长因子调控的机制目前还缺乏认识，仍需深入探索。

2.2KLK诊断卵巢癌的价值 KLK6可能与卵巢癌诊断、高级别分化、组织类型、残留肿瘤组织、无瘤生存期以及化疗反应性有关[30]。此外，与健康人或其他类型癌症患者相比，56%的卵巢癌患者血清中人激肽释放酶10的水平显著升高。人激肽释放酶10可能是诊断卵巢癌的一个新的血清学指标[31]。早期卵巢癌患者血清中的KLK6和KLK7蛋白水平显著升高，这可能有助于降低人附睾蛋白4和糖类蛋白125的假阴性率；而KLK6和KLK7 mRNA过表达与早期卵巢肿瘤直接相关，并可在患者组织和血清中检测到[32]。人激肽释放酶5在卵巢癌患者血清中亦高表达，具有潜在诊断价值[4]。在卵巢癌患者的组织提取物、血清和腹水中可检测到人激肽释放酶8，提示可能是一种新的卵巢癌标志物；同时在卵巢癌患者的血清和腹水中检测到的KLK8与KLK6具有显著相关性[33]。不同于其他在卵巢癌中高表达的KLK，KLK11在卵巢癌组织中的表达水平明显低于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织，故KLK11对卵巢癌早期诊断有验证价值[34]。

2.3KLK治疗卵巢癌的价值 KLK家族多个成员的调控失调在卵巢癌中发挥了重要作用。KLK在卵巢癌微环境中不仅可以介导癌症进展和化疗耐药，同时也是新抗癌方法和药物开发的有效靶点。研究表明，环状RNA(hsa-circ-u0051240)通过抑制miR-637/KLK4轴促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭[35]，因此hsa-u-circ-u0051240/miR-637/KLK4轴可作为卵巢癌治疗的靶点。KLK3～12、KLK13～15在扁桃体组织提取液中的表达水平高于淋巴结和脾脏组织，其中KLK9在B细胞活化的淋巴滤泡生发中心有较强的表达，而KLK10在维持B细胞成熟起重要作用的滤泡树突状细胞中有较高的表达[36]。以上研究提示，KLK在免疫细胞中存在差异表达，其有望成为免疫相关疾病和癌症免疫疗法的靶标。

Raza等[37]通过计算KLK8与其抑制剂的结合活性发现，锌指蛋白02927490对KLK8的S1位点具有较高的结合特异性，其有助于改进目前的治疗药物，增加靶向治疗的特异性。KLK4在其他癌症中通过激活基质金属蛋白酶促进细胞侵袭和转移[38]，KLK特异性小干扰RNA有效降低了KLK4的表达水平和活性，同时也抑制了癌细胞的增殖和侵袭[39]。针对KLK的特异抑制剂(包括肽类抑制剂、小分子抑制剂、环肽、工程天然抑制剂等)正在研究中，KLK4～6不仅可作为炎症疾病的靶点，也可作为抑制卵巢癌的首选靶点[26]。但这些治疗靶点仍需要进一步的研究证实，特别是在同质患者队列或明确定义的细胞和临床前疾病模型中。

miRNA和干扰小RNA调节KLK蛋白的水解活性，已被开发用于各种组织修复和抗癌治疗[40]。有研究证实，干扰小RNA抑制KLK14的表达可明显抑制卵巢癌细胞的体外恶性行为，增加细胞凋亡率[41]。

2.4KLK预测卵巢癌预后的价值 KLK可作为判断卵巢癌预后的生物标志物。KLK4 mRNA表达水平升高与卵巢癌患者总生存期缩短显著相关，且KLK4在调节细胞增殖、黏附、侵袭以及迁移等方面具有重要作用，其可能是卵巢癌不良预后的独立预测指标[42]。研究表明，KLK6 mRNA表达水平升高亦与卵巢癌患者总生存期缩短显著相关，KLK6不仅是卵巢癌不良预后的生物标志物，也是卵巢癌治疗的潜在靶点[43]。此外，KLK5 mRNA表达水平升高与无进展生存期缩短显著相关，而与总生存期无关，故KLK5 mRNA亦可以作为判断卵巢癌不良预后的生物标志物[4]。

有研究全面量化了晚期高级别浆液性卵巢癌的同质患者中肿瘤相关KLK的表达水平，并评估了KLK对疾病进程的影响，结果发现，KLK9 mRNA和KLK10 mRNA的表达水平与卵巢癌患者预后无关，但KLK15 mRNA、KLK11 mRNA的高水平与卵巢癌预后较好相关[43]。KLK10和KLK11在晚期浆液性卵巢癌中协调表达，两者编码的蛋白质表达增加与卵巢癌良好预后相关[44]。Dettmar等[45]发现，卵巢癌组织中KLK13 mRNA与KLK14 mRNA的表达呈负相关：KLK13 mRNA水平升高与较短的无进展生存期和总生存期显著相关，而KLK14 mRNA水平升高与较长的无进展生存期和总生存期显著相关，表明KLK13 mRNA和KLK14 mRNA是预测卵巢癌复发和评估预后的独立指标。

2.5KLK在卵巢癌化疗耐药中的作用 顺铂联合紫杉醇方案仍是晚期卵巢癌及复发性卵巢癌的主要化疗策略，但复发性卵巢癌化疗耐药亟须解决。鉴于联合高表达的KLK4～7增强了卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性，故抑制KLK可能是治疗晚期卵巢癌化疗耐药的一种新方法[26]。KLK4可促进多细胞团簇的形成，从而导致卵巢癌耐药性的产生，用免疫球蛋白G抗体和高度特异的SFTI-FCQR(一种选择性活性位点KLK4丝氨酸蛋白酶抑制剂)抑制KLK4的活性可提高紫杉醇治疗卵巢癌细胞的效率[46]。目前KLK在卵巢癌耐药方向的研究尚不完善，还需大量研究验证其与卵巢癌耐药的相关性。

3 展 望

目前对卵巢癌病理生理学的研究为开发作用于特定信号通路或干扰肿瘤微环境因素的靶向治疗提供了方向，但仍缺乏合适的生物标志物以早期检测、指导靶向药物治疗及评估患者预后。尽管进行了广泛的研究，但通过筛查程序和寻找有效的生物标志物或新的治疗策略改善卵巢癌患者生存预后的总体结果尚不理想。随着对KLK家族成员研究的深入发现，在肿瘤组织中差异表达的KLK在其他器官和组织中表达受限，KLK可能是合适的卵巢癌治疗靶点。KLK不仅是卵巢恶性肿瘤微环境中重要的因子，介导肿瘤的发生、发展，也与化疗药物耐药密切相关，同时也是新的抗癌方法和药物开发的有效靶点。KLK对早期卵巢癌的预测作用在实验室中得到了证实，但在实际临床中的诊断价值仍存在争议。KLK在卵巢癌早期诊断、评估预后，监测复发等方面的敏感性和特异性还有待进一步提高，以克服传统卵巢癌标志物的单一性和局限性。目前仍需要对KLK家族进行深入探索，以期进一步提高KLK在卵巢癌预后判断以及作为早期诊断标志物的价值，改善卵巢癌患者的生存率和生存质量。