低能量激光照射疗法调节间充质干细胞生物学效应研究进展

思黛伟 王新涛

间充质干细胞(MSC)在组织工程和再生医学中有重要作用，低能量激光照射疗法(LLLT)可以促进MSC的增殖及成骨分化，被认为是组织工程中很重要的影响因素[1-2]。LLLT是指细胞或组织暴露于弱光后，通过特殊的光电子效应调节其生物学功能[3]。LLLT对MSC生物学效应的调节作用受到许多因素影响，可表现为正向或负向调节。随着研究的深入，LLLT对细胞的正向调节作用得到越来越多的重视。然而，许多研究中所选择的LLLT参数存在差异，导致研究结论不一致[4-5]，使得现有的LLLT对MSC的生物学效应的研究数据难以令人信服，并阻碍了LLLT应用的标准化。

1 对MSC生物学效应的影响

1.1 细胞增殖

实验研究结果显示LLLT能促进MSC增殖。Min等[4]用LLLT处理体外培养的MSC,随后将其移植入大鼠体内，发现LLLT不仅可以促进MSC在体外增殖，也可以促进其在体内增殖。Cavalcanti等[6]认为，LLLT促进MSC增殖与细胞周期改变相关。LLLT能促进MSC向G2/M期转变，从而导致细胞快速增殖，且转变程度随LLLT能量密度的增加而增加。然而也有一些研究显示，不适当的LLLT对MSC具有不良效应，表现为抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等，这些不良效应可能与MSC内活性氧(ROS)生成增加和DNA损伤相关[5]。总而言之，LLLT对MSC增殖的效应受多种因素影响。

1.2 成骨分化及矿化

MSC分化为成骨细胞是发挥成骨作用促进骨再生的重要保障，该分化过程可分为2个阶段：第一阶段在1～2周内，此时细胞缓慢增殖，表达碱性磷酸酶(ALP)活性和骨特异性基因，并产生胶原基质；第二阶段在2周后，此时基质矿化形成结节，矿化结节是MSC成骨分化后期的重要生物学标志。Zhang等[7]的研究结果表明，在成骨诱导基上LLLT可促进MSC向成骨分化，并产生矿化结节；茜素红染色结果显示，LLLT组MSC产生的矿化结节数量明显多于单纯成骨诱导剂组。众所周知，由去卵巢大鼠骨髓获得的MSC(OVX-BMSC)成骨能力受损。而Fallahnezhad等[8]报道，LLLT也能促进OVX-BMSC在成骨诱导过程中形成矿化结节。

2 基本参数

LLLT对MSC的生物学效应受多个基本参数的影响。

2.1 波长

LLLT对MSC的生物学效应受波长影响。LLLT的主要应用波长为420～1 064 nm，最常应用的波长段为420～540 nm(蓝绿光)和660～810 nm(红光及近红外光)，两者均可促进MSC的成骨分化，后者还可促进MSC的增殖。Zhu等[9]使用波长为420～480 nm的LLLT来调节MSC，发现LLLT使MSC的细胞增殖降低，但可显著促进Ⅰ型胶原蛋白、RUNT相关转录因子2(Runx2)、骨钙素等成骨基因的表达，提高成骨分化标志物ALP的活性，增加矿化结节数量。Merigo等[10]的研究发现，波长为532 nm的LLLT可促进MSC的成骨分化及其细胞外基质的矿化，但对MSC的增殖影响较小。Fekrazad等[11]研究不同波长LLLT对MSC的影响，发现波长为810 nm的LLLT促进MSC增殖和成骨分化的效果最强，其次为660 nm波长的LLLT，而532 nm波长的LLLT抑制细胞增殖的作用最强。同样，Wang等[12]对比研究4种不同波长LLLT(420 nm、540 nm、660 nm、810 nm)对MSC增殖及成骨分化的影响，发现660 nm和810 nm波长的LLLT能促进MSC的增殖和成骨分化，与之相比，420 nm和540 nm波长的LLLT在促进MSC向成骨细胞分化方面虽然更有效，但却抑制MSC的增殖。

综上所述，420～540 nm波长的LLLT虽然可以促进MSC向成骨分化，但抑制MSC的增殖；660～810 nm波长的LLLT既可促进MSC增殖，又能促进成骨分化，是LLLT调节MSC生物学效应较为理想的波长。此外，联合不同波长的LLLT对MSC的生物学效应也有影响。Zare等[13]的实验研究发现，双波长(630 nm和810 nm)LLLT能显著促进MSC增殖。近年有学者报道，使用多波锁定系统同步发射2种波长(808 nm和905 nm)的LLLT可明显促进MSC的增殖[14]。

2.2 能量密度

能量密度是LLLT中重要的基本参数，其可影响LLLT对MSC的生物学效应，并使LLLT遵循“Arndt-Schultz定律”，即太弱的刺激不会引起任何生物学反应，而太强的刺激则具有抑制作用[15]。文献报道，能量密度为0.3～12 J/cm2时有利于LLLT调节MSC的生物学效应。Mccolloch等[3]进行研究采用能量密度为1～12 J/cm2的LLLT连续3 d照射MSC，结果显示能量密度与MSC的增殖效应呈正相关，LLLT可诱导G0/G1期细胞向G2/M期转变，从而促进MSC的增殖。Wang等[16]使用能量密度分别为2、4、8、16 J/cm2的LLLT对正常或炎性环境下的MSC进行间隔1 d照射1次，7 d后检测细胞的增殖及成骨分化情况。他们发现，能量密度为4 J/cm2的LLLT能显著促进MSC的增殖和成骨分化；但在炎性微环境中，需要能量密度为8 J/cm2的LLLT才能显著促进MSC的增殖和成骨分化。而LLLT能量密度较高(16 J/cm2)时，对正常和炎性环境下MSC的增殖和成骨分化均有显著抑制。此外，Károly等[17]报道，能量密度为1.9 J/cm2和3.8 J/cm2的LLLT均可促进MSC的增殖，且在24 h内3.8 J/cm2照射1次与1.9 J/cm2照射2次，其促进MSC增殖的生物学效应是一致的。实际上，LLLT调节MSC生物学效应的最佳能量密度还与其他实验条件相关。Wang等[18]的研究显示，波长为980 nm的LLLT刺激MSC增殖的最佳能量密度为0.3 J/cm2，而波长为810 nm时则为3 J/cm2。

2.3 类型

LLLT类型的多样性有时可造成互相矛盾的实验结果。研究中通常采用的LLLT类型有氦氖激光器、半导体激光器和发光二极管(LED)，其中常用的半导体激光器包括砷化镓、掺钕钇铝石榴石、砷化镓铝(GaAlAs)、铟镓铝磷化铝(In-Ga-Al-P)激光器等[19]。目前有争议的是LLLT相干性是否影响MSC的生物学效应。因为LED为非相干、发散的LLLT，因此LED的能量不集中，可能需要特殊光学装置将能量集中到目标区域。Tani等[20]比较不同类型LLLT对MSC生物学效应的影响，发现与对照组相比，LED类型的LLLT对MSC的生物学效应并无影响，而使用同样能量密度的GaAlAs类型的LLLT则能促进MSC的增殖和成骨分化。另一项研究表明，LED类型的LLLT对MSC的增殖虽无明显影响，但可通过Wnt/β-catenin信号转导通路促进MSC的成骨分化和矿化[21]。虽然有研究结果支持LLLT不依赖于激光的相干性[22]，但关于LED与相干激光是否等价仍然是光生物学效应领域有争议的问题。

3 照射情况

3.1 照射频次

LLLT照射频次对MSC的生物学效应有较大影响。Li等[23]比较多次与单次应用LLLT对MSC的影响，在13 d内对培养的MSC进行多次(每隔1 d 1次)或单次LLLT照射，发现单次LLLT照射时MSC数量仅在照射后2 d内高于对照组,而多次LLLT照射时MSC数量一直高于对照组。他们[24]进一步研究发现，多次LLLT照射可进一步提高MSC的成骨分化能力。Almeida-Junior等[25]对比单次与多次LLLT照射对MSC的影响，多次LLLT照射的间隔时间为6 h，结果表明同等条件下3次LLLT照射较单次照射促进MSC增殖的效果更强；考虑到LLLT照射频次不同可造成MSC接受能量不同，他们还对比应用1次LLLT照射与同等能量分3次应用LLLT照射对MSC的影响，结果表明分3次进行LLLT照射能更好地促进MSC增殖。

3.2 照射时间

照射时间也可以影响LLLT对MSC的生物学效应，且照射时间与MSC的生物学效应并非呈正相关。Yin等[26]使用LLLT调节MSC的生物学效应，照射时间分别为1 h、2 h、3 h，结果表明LLLT通过调节细胞周期进程促进MSC增殖，且照射时间为1 h时对细胞的增殖效应最大。Amaroli等[27]使用808 nm波长LLLT对MSC分别进行连续5 d、10 d、15 d的照射，发现连续照射5 d成骨分化的重要早期标志物Runx2表达开始增加，连续照射10 d Runx2表达达到最大值，连续照射15 d Runx2的合成反而减少。因此，在LLLT调节MSC的生物学效应时，必须控制照射时间才能达到理想结果。

3.3 照射面积与传输系统

LLLT的照射面积与能量密度关系密切。de Villiers等[28]采用照射面积为9.1 cm2、能量密度为5 J/cm2的光斑照射MSC，该光斑可覆盖整个培养孔表面，发现照射后3 d内LLLT组的MSC数量显著高于对照组。de Andrade等[29]使用极小光斑(面积为0.028 cm2)照射MSC，发现也能促进MSC增殖，然而他们未描述极小光斑是如何照射整个培养孔中MSC的。通常可靠的方法是通过扫描照射培养孔中全部MSC[14]。但也有研究显示，即使LLLT照射面积小于培养孔面积的1/10，也能对MSC产生有益的生物学效应[30]。

LLLT的光束传输系统依据光通量分布可分为2种：“标准”光束传输系统(高斯光通量分布)和“flat-top”光束传输系统(均匀光通量分布)。Hanna等[31]的研究显示，“flat-top”光束传输系统因散发的光斑横截面上各点能量分布均匀，更有助于提高细胞的生物学活性，从而更有益于细胞的成骨分化。相反，“标准”光束传输系统散发的光斑横截面上呈中心高周围低的能量分布，可能对MSC生物学效应影响较小[32]。

3.4 作用细胞

LLLT可调节许多类型MSC的生物学效应。实验中所用MSC可取自人、鼠、马、兔、犬等不同物种，组织来源包括骨髓、脂肪、牙、滑膜等，从细胞培养传代来看，通常使用原代、3代、4代细胞[33]。脂肪组织来源的MSC也可向成骨细胞分化，由于其具有取材方便、创伤小等优点[34]，近年受到越来越多的关注。从细胞生理特性划分，MSC可以是健康的也可以是病态的[35]，病态MSC(如高糖微环境下的MSC)的存活力和增殖力均明显受损。 Zare等[36]采用波长为632.8 nm、能量密度为1 J/cm2、频率为1～2次的LLLT照射改善了高糖微环境下MSC的增殖力。

3.5 细胞培养基

细胞培养基也影响LLLT对MSC的生物学效应。常用的细胞培养基有改良Eagle’s培养基(DMEM)和成骨诱导培养基(ODM)。Yang等[37]研究发现，LLLT对DMEM中MSC的生物学效应并无影响，但可显著促进ODM中MSC的增殖和成骨分化，可显著上调MSC成骨分化的重要标志物骨桥蛋白基因的表达，促进矿化结节形成。Peng等[38]比较ODM与DMEM两种培养基中LLLT对MSC的影响，结果表明不同培养条件下可表现出不同的生物学效应。在DMEM中LLLT可促进MSC的增殖，但不诱导其成骨分化，在ODM中LLLT可促进MSC成骨分化，但抑制其增殖。

4 结语

LLLT作为一种物理方法调节MSC时具有操作简便、廉价、高效等优点，并可以联合其他化学物质共同调节MSC的生物学效应。合理使用LLLT可以促进MSC的增殖及成骨分化，在骨组织工程中具有重要应用价值。考虑到实验条件的限制和方法的异质性，设计可同时包含所有影响因素的实验非常困难，因此需进一步探索LLLT的各项最佳参数及照射情况(波长、能量密度、照射频次等)，以更好地发挥其调节作用。