E3 泛素连接酶CUL2 在宫颈癌中的研究进展

张宏蕾，赵卫红

泛素化是蛋白质在翻译后的重要修饰之一，是蛋白质被降解前的信号，即需要被降解的蛋白质会先被泛素化标记，形成泛素-蛋白质复合体，之后再被26S 蛋白酶体降解[1]。在这个生物过程中需要E1泛素激活酶、E2 泛素转移酶和E3 泛素连接酶来完成。泛素连接酶复合体（cullin-ring ligase，CRL）是体内最大的E3 泛素连接酶家族成员，蛋白通过识别受体底物形成复合物，发挥泛素化蛋白质降解作用[2-3]。在大多数癌症中下调的肿瘤抑制因子希佩尔-林道（von Hippel-Lindau，VHL）因子是一个在缺氧信号转导与致癌途径中重要的分子，通过与E3 泛素连接酶复合体形成复合物调节其底物，CUL2 蛋白因主要识别VHL 受体底物，参与形成E3 泛素连接酶复合体，曾被学者们预测为肿瘤抑制蛋白。然而近年研究显示，CUL2 在宫颈癌、肾透明细胞癌、胃癌、肝细胞癌、食管癌等恶性肿瘤中以发挥促癌作用为主，现对CUL2在恶性肿瘤尤其是宫颈癌中的作用及其机制进行综述。

1 CUL2 概述

现已知，Cullin 家族有7 个成员，分别为CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5 和CUL7[4]。而在人类、狗、牛、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇和秀丽隐杆线虫中表现出保守性的CUL2 基因是Cullin 家族中不容忽视的一员。CUL2 是由745 个氨基酸组成Cullin家族中的成员之一，由Cullin2 基因编码，位于人类第10 号染色体（10p11.21），分子质量约87 ku，等电点为6.46。Cullin 参与泛素复合体的组成，为泛素连接酶E3 提供疏水蛋白骨架，具有高度保守性，并几乎存在于所有真核生物。在CRL 中表型最好的泛素连接酶是SCF（Skp-Cul1-F-box）和ECS（EloCCUL2/5-SOCS-box），因CUL2 有与环指蛋白1（Ringbox 1，RBX1）相互作用的羧基（C）末端，RBX1 会招募E2 泛素转移酶，发挥连接Cullin 与E2 的作用；另一端氨基（N）末端则会与延长蛋白（ElonginB/C）相互作用，起到接头蛋白的作用，使CUL2 与底物受体结合[5]。这些可以与ElonginB/C 连接的底物受体都含有一个特殊的结构域——VHL 盒，有趣的是，起初VHL 被认为是SOCS 盒蛋白，但后来发现VHL缺乏SOCS 盒中的C 末端[6]。VHL 盒由BC 盒（负责与ElonginB 和C 结合）和CUL2 盒（负责与CUL2 结合）构成，随着对VHL 盒研究的深入，发现含有这个同源性结构域的蛋白很多，如VHL、富含亮氨酸重复蛋白1（leucine-rich repeat protein 1，LRR-1）和性别决定蛋白FEM1，除此之外的更多底物识别位点被发现，底物识别的更多方面被阐明，深入了解CUL2 与其底物之间的关系为癌症研究开辟了一个新的领域。

2 CUL2 与宫颈癌

众所周知，高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发生的必要因素，以HPV16 最为多见，保守的E7 癌蛋白是HPV16 致癌的关键，E7 癌蛋白靶向视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）使宿主细胞顺利进入S 期，并促进上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和细胞迁移[7-8]。最近的研究表明，CUL2 参与了E7 介导HPV16 感染的宫颈癌细胞中pRb 的降解，CUL2 在HPV16 基因型的感染中可能扮演着不同于其他高危型HPV 的角色。HPV16 E7和CUL2 结合通过泛素蛋白酶体依赖的机制使pRb的稳定性和稳态下调[9]，而细胞周期的G1/S 调控点正是pRb 发挥作用的时间点，若pRb 被病毒干扰不能与转录因子（E2F transcription factor 1，E2F1）结合，细胞则会顺利进入S 期进行增殖，病毒也就可以利用这个时机进行DNA 复制，从而促进宫颈癌的发生发展[10]。研究表明利用RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术敲除CUL2 基因会使pRb 呈稳定的高表达，因此CUL2 被反向证明是宫颈癌变过程的关键分子[11]。近年研究发现在HPV16 阳性的宫颈癌细胞中，CUL2 受微小RNA-424（miR-424）和miR-154调控，从而参与HPV16 诱导的宫颈癌变[12-13]。

此外，高危型HPV 癌蛋白E7 有延长人角质形成细胞和载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化多肽样蛋白3（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3，APOBEC3）半衰期的作用，APOBEC3 蛋白是一种淋巴免疫细胞的蛋白质，具有广谱的抗逆转录病毒作用[14]。其中APOBEC3 家族中的A3A 是一种专门针对和限制外来DNA 分子的蛋白，可促进外源DNA 分子的分解和代谢[15]，也正是由于A3A 的稳定是CUL2 与E7 蛋白结合基序中的某些残基所介导，因而做出了E7-CUL2 复合物可能调节A3A 水平的假设，结果如预计的那样，HPV16 E7 的表达阻止蛋白酶体依赖的A3A 蛋白降解来稳定人角质形成细胞中A3A 蛋白的水平。因为一些在HPV16 E7 的影响下稳定的蛋白质都是通过CRL2自然降解的，说明A3A 蛋白的异常稳定是由于CUL2的功能结构域被E7 蛋白所占据而导致A3A 不能如期降解，这种异常的A3A 蛋白稳定活性可以激活DNA损伤反应[16]，HPV 的DNA 复制又依赖于宿主细胞的DNA 损伤反应，这也是HPV 从该机制中获得的另一有利生存的条件。

3 CUL2 促肿瘤发生的可能作用机制

3.1 促进肿瘤血管生成 VHL 综合征表现为一系列病变，包括肾细胞癌、中枢神经系统或视网膜的血管母细胞瘤和嗜铬细胞瘤[17]，多因为VHL 肿瘤抑制蛋白的BC 盒发生了突变或表达缺失所引起[18]。Cai等[19]在研究miR-21-5p 在宫颈癌中的过表达时，发现了VHL 的mRNA 序列上3′非翻译区是miR-21-5p的直接靶点，miR-21-5p 通过下调VHL 促进宫颈癌的转移。CUL2 是VHL 抑癌复合物的组成成分，而大多数致病性突变的VHL 会抑制ElonginB/C-CUL2-VHL抑癌复合物的形成，因此探索CUL2 在该复合物中的作用与其生物效应显得尤为重要。VHL 在正常氧气量的生理状态下靶向缺氧诱导因子1α（HIF-1α），HIF-1α 是一种可介导缺氧敏感基因表达的转录因子，在机体缺氧反应时发挥作用，经典途径是介导缺氧敏感基因血管内皮生长因子的表达上调，促使血管的生成。Guo 等[20]发现HPV E6 癌蛋白可以阻断VHL 与HIF-1α 结合，阻碍HIF-1α 的降解，稳定堆积的HIF-1α 诱发瓦伯格效应（Warburg effect），葡萄糖更多地转运到肿瘤细胞，形成了适宜的肿瘤微环境，HIF-1α 被认为是调节多种肿瘤发生的信号分子和转录因子活性的信号枢纽。此外，CUL2 小干扰RNA（siRNA）会抑制芳香烃受体核转运体的表达来调节HIF，该转运体可与内源性HIF-1α 形成异源二聚体。而异位表达的芳香烃受体核转运体在内皮生长因子的启动子中可逆转CUL2 siRNA 对HIF 活性的抑制。尽管在VHL 与CUL2 组成的泛素连接酶复合体中，CUL2 的N 末端延伸可与VHL-ElonginB/C相互作用，但是研究发现在缺乏VHL 的786-O 细胞中，CUL2 siRNA 同时抑制了芳香烃受体核转运体和内皮生长因子的表达，表明CUL2 可以独立于VHL 调节HIF 活性，证明CUL2 对于正常血管生成的驱动过程是必不可少的生物分子。由此看来，VHL 可招募CUL2 E3 泛素连接酶泛素化并降解HIF-1α，HIF-1α有激活血管和红细胞生成过程的基因转录作用，所以有学者指出若是可以抑制HIF-1α 的降解以增加促红细胞生成素的产生，则可作为治疗缺血和慢性贫血的新疗法。CUL2 之所以被预测为肿瘤抑制蛋白，是因为其与VHL 基因和HIF-1α 的泛素化降解有关，且CRL2 VHL 的底物多样性使得E3 泛素连接酶复合体具有了功能多样性[21]。

3.2 调节细胞动力 根据氨基酸序列分析，不同蛋白质中的VHL 盒不但相似而且高度保守，拥有这种结构域的富含亮氨酸重复蛋白1（LRR-1）是CRL2复合体（CRL2LRR-1）的核底物识别亚单位[21]，其结构域中同样含有BC 盒和CUL2 盒，这样独特的结合基序在体内与体外都被证明发挥了与CUL2 结合的功能。CUL2LRR-1 是细胞动力的关键调节者，人类CUL2LRR-1 通过阻止细胞质中的p21 抑制Rho/ROCK/LIMK 通路以促进细胞静止状态，是细胞运动的关键调节因子。且人类LRR-1 是丝切蛋白的负向调节因子，丝切蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，介导了细胞内的多种信号通路，丝切蛋白的激活会导致片状伪足的形成[22]，影响肿瘤细胞的运动，进而增强或减弱肿瘤细胞的迁移与侵袭。目前，已在宫颈癌、肝癌、结肠癌、胃癌及肾癌的浸润性肿瘤细胞中检测到丝切蛋白表达上调[23]。

3.3 诱导肿瘤免疫逃逸 黑色素瘤特异性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME）也是拥有特异VHL 盒的蛋白质，其是在1例黑色素瘤患者体内被鉴定为发生自体抗肿瘤免疫反应的特异性抗原，目前PRAME 被认为在人体正常组织中不表达，在血液系统肿瘤、乳腺癌和肾癌等恶性肿瘤中过度表达，并且被证明与黑色素瘤病变分期有关，与神经母细胞瘤、浆液性卵巢瘤患者的预后有关，在临床上高水平的PRAME mRNA 是乳腺癌患者预后不良的因素[24-25]。值得注意的是，这种肿瘤抗原上亦存在VHL 盒，VHL 盒在PRAME 蛋白的N-末端，成为PRAME 与CUL2 的中间媒介，提示PRAME 在发挥生物效应时很可能就是借助了E3 泛素连接酶中重要的组成成分CUL2，也就是说这种癌蛋白的致癌性与泛素化存在着功能性联系。染色质免疫共沉淀-高通量测序（ChIP-Seq）显示PRAME经常占据转录活性启动子区域，该区域也被核转录因子Y（nuclear factor Y，NFY）结合，包括NFY A和NFY B，NFY 是促进早期胚胎发育、细胞增殖的重要转录因子[25]。而且具有降解性的NFY A 突变体可以促进细胞增殖，这与恶性肿瘤的发生有着一定的因果关系。研究发现，PRAME 被特异性地招募到具有转录活性的NFY 启动子中，PRAME 的结合可预测NFY 基因座是否具有活性，因此PRAME 在转录调控中的作用不容小觑[25]。PRAME 的其他潜在底物仍有待确定，随着未来更多底物的揭示，PRAME 与CUL2 的合作关系及其在多种类型的人类癌症中作为潜在癌基因的分子机制也将会被揭晓。

3.4 调控细胞增殖 可对CUL2 起修饰作用的类泛素蛋白NEDD8 修饰Cullin 亚基中单个保守的赖氨酸残基，改变C 末端环结合域的构象结构，由此决定了相应CRL 的激活与否，构象开放的CRL 方便了与底物的结合[26-27]，CRL 的识别底物是一些调节细胞功能的关键分子，CRL 被认为是潜在的抗癌靶点，因此NEDD8 激活酶作为NEDD8 结合途径的重要组成部分极其重要。目前发现，NEDD8 激活酶抑制剂可解除其对细胞周期S 期DNA 合成的调控，值得庆幸的是，一种NEDD8 激活酶抑制剂MLN4924 可使CRL失活，表现其抗癌活性[28]，NEDD8 激活酶抑制剂可阻断Cullin 环类泛素化修饰，导致CRL 底物的积累并诱导肿瘤细胞凋亡。由于泛素-蛋白酶系统的抑制剂对治疗癌症有所帮助，且抑制NEDD8 激活酶通路比抑制蛋白酶体活性能更有选择性地破坏癌细胞蛋白质的稳态，从临床疗效的角度讲，这种疗法具有更高的可行性[29]。

肿瘤抑制因子Ras 同源物家族成员B（Ras homolog family member B，RhoB）通过调节多个下游效应器来控制多种与癌症相关的重要信号通路，RhoB 在肝癌组织中表达下调，且通过蛋白质组学的分析，RhoB 被认定为Cullin-RBX1-E3 连接酶的一种底物，被NEDD8 耦联激活后的Cullin-RBX1-E3连接酶与RhoB 相互作用，促使这种肿瘤抑制因子的泛素化和降解，RhoB 并不是与任何一个Cullin 家族的蛋白都可发生上述效应，内源RhoB 仅与CUL2相互作用。人肝癌组织中过表达的RBX1 与CUL2一起作用于RhoB 使其降解，可以说CUL2-RBX1-E3连接酶是肝癌中RhoB 的调节器，在人肝癌组织中Neddyling-CRL 途径的过度激活与RhoB 水平呈负相关，反过来说明了RhoB 被泛素化降解是部分导致肝癌发生的原因[30]。目前研究证实了MLN4924 会抑制NEDD8 对CRL2 的耦联，使CRL2 失活，从而导致CUL2 对RhoB 的泛素化作用下调，RhoB 的积聚会触发细胞凋亡，抑制肝癌细胞的生长。

3.5 调控EMT Twist 是一种关键的促EMT 的转录因子，可上调间充质细胞表型相关的基因蛋白——波形蛋白（Vimentin）表达，EMT 是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。通过结合位点分析，Twist1 可结合CUL2的启动子，启动其环状RNA（circ10720）的转录[31]，导致了CUL2 circ10720 的异常形成，但不促进mRNA表达，circ-10720 可以海绵吸附调控波形蛋白的miRNA，使波形蛋白也异常表达[31-32]，而波形蛋白正是EMT 间充质细胞的重要标志物。Twist1 通过增加可吸收波形蛋白miRNA 的circ10720 来上调波形蛋白水平这个环节，可能就是circ10720 肝癌细胞中circ10720 与Twist1、预后不良、肿瘤恶变程度呈正相关的原因。有研究报道，在体外和患者来源的异种移植瘤和二乙基亚硝胺诱导的Twist1 转基因小鼠肝癌模型中，circ10720 基因敲除能消除Twist1 的促瘤活性[31]。此外，还利用荧光素报告系统验证Twist1 过表达增加了CUL2 启动子活性，而Twist1 的基因敲除降低了CUL2 启动子活性，正反双向的实验验证了Twist1在EMT 过程中调节波形蛋白的机制。CUL2 circ10720在转移性肝癌和甲胎蛋白阳性组的肝癌组织中呈显著性持续增高，为肝癌的治疗提供了潜在的治疗靶点，将会是一种新的诊断和治疗策略。汪雯雯等[33]在研究中表明Twist 通过诱导EMT 参与了宫颈癌发生的整个过程，并与宫颈鳞状上皮细胞癌抗原淋巴结转移呈正相关。Babion 等[34]研究发现，宫颈癌中有双重作用的miR-9-5p 的靶点之一是EMT 的转录因子Twist1。

4 结语与展望

CUL2 蛋白在一系列富含VHL 盒受体底物的泛素化过程中起着决定性作用，其中备受关注的VHL基因在宫颈鳞状细胞癌与非癌组织中呈现了不同的状态，Choi 等[35]检测发现VHL 在宫颈鳞状细胞癌中甲基化，超甲基化的肿瘤抑制基因表达沉默参与了宫颈癌的发生。CUL2 与VHL、ElonginB、ElonginC 形成的ElonginB/C-CUL2-VHL 复合物在肿瘤的发生发展中发挥关键的抑癌作用，在宫颈癌中又表现出促癌作用，寻找调控CUL2 的机制成为了阻断恶性肿瘤发生发展的关键点，如有文献报道miR-574-3p可以通过靶向调节CUL2 成为治疗胃癌和膀胱癌的新靶点[36-37]。鉴于CUL2 作为HPV16 E7 降解抑癌蛋白pRb 过程中的关键分子，相信未来随着对CUL2的进一步研究，CUL2 有望成为判断宫颈癌发生和预后的分子标志物，并为阻断宫颈癌的发生提供新靶点。