MicroRNA与肝纤维化相关的研究进展

音铭 李文庭

肝纤维化是肝脏的一种损伤-修复过程，其特征就是细胞外基质(Extra cellular matrix，ECM)过度增生并沉积在肝脏，导致肝脏结构和功能的异常。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节[1-2]。肝活检被认为是评价纤维化的金标准。然而，该技术有创，可重复性差，这些特点限制了其临床应用。目前无创诊断方法越来越受到人们的推崇，临床上常用的无创诊断包括基于影像的无创诊断模型和基于血清学指标的无创诊断模型，但目前的模型诊断准确性会受肥胖、高黄疸等多种因素的影响，且其特异性和敏感性较低，所以应用在临床实践中准确性不高[3]。目前，越来越多的研究学者都在寻找敏感性、可靠性高的肝纤维化无创生物标志物。

MicroRNA(miRNA)是一种长约22个左右核苷酸的内源性非编码单链小RNA，通过调节RNA的转录以及转录后修饰等生物学过程来调节相关基因表达[4]。miRNA不仅存在于各种组织和细胞中，还稳定地存在于循环血液中。已有研究表明，miRNAs可以通过靶向与肝星状细胞活化、免疫细胞反应和肝细胞凋亡相关的分子过程中的底物结合来调控肝纤维化进程[5-7]。在这篇综述中，我们将分析miRNA在肝纤维化进展中的作用，并为肝脏纤维化的诊断和分子靶向治疗提供新的思路。

一、抑制肝纤维化进展的miRNA

(一)miR-185 miR-185由人体22q11.21染色体上的基因编码，它最初被描述为癌症进展的调节因子。大量研究显示，miR-185与肝病关系密切。Li等[8]对149例患者(肝癌40例，肝硬化54例，慢性丙型肝炎患者55例)及45名健康对照者血清标本进行测序，结果显示，肝癌患者血清miR-185水平明显低于肝硬化患者，进一步统计学分析表明，miR-185具有良好的肝癌诊断价值。同样，miR-185在HBV及相关肝癌的发病机制中发挥重要作用。体外研究显示，miR-185-5p能与肝细胞核内转录因子ELK1结合，显著抑制HBV蛋白表达及HBV复制；在肝细胞内过表达ELK1能促进HBV复制，且能逆转miR-185-5p对HBV复制的抑制效应[9]。

miR-185与纤维化的关系也得到了证实。Sun等[10]研究显示，TGF-β1通过内质网应激(Endoplasmic reticulum,ER)促进HK2细胞(人肾上皮细胞系)活化并表达ɑ-SMA，促进肾纤维化的进展；此机制是通过上调HK2细胞ATF6(activating transcription factor 6)实现的；miRNA-185可与ATF6结合，下调ATF6活性，抑制HK2细胞活化。同时，在单侧尿道梗阻小鼠模型(unilateral urethral obstruction,UUO)，miR-185-5p能显著抑制肾纤维化的进展。Wang等[11]研究显示，miR-451与星状细胞XPO-1结合，上调miR-185活性，两者均与EphB2(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2)结合，下调EphB2表达，从而抑制星状细胞活化。同样，该机制在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中得到验证。这些结果提示miR-185可能成为肝纤维化治疗的新靶点。

(二)miR-29 新近研究显示，miR-29在组织纤维化过程中发挥抑制作用。Huang等[12]探索了miR-29a在非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用。研究人员构建了miR-29a转基因小鼠并给予高脂饮食诱导NAFLD小鼠模型。结果显示，miR-29a转基因小鼠(miR-29a+NAFLD)体质量明显低于NAFLD模型小鼠；miR-29a能减少NAFLD小鼠肝脏胶原纤维(collagen1ɑ1,Col1A1)沉积，降低肝组织IL-6、MCP-1、过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)等炎症因子表达。进一步细胞实验表明，miR-29a通过抑制肝细胞CD36表达发挥抗肝纤维化作用。Xu等[13]深入探索了组氨酸脱甲基酶KDM4/miR-29与星状细胞活化的关系。研究结果显示，与静息星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)相比，活化的HSCs高表达Acta2，但其KDM4明显低于静息HSCs。研究团队还分离了小鼠原代HSCs，在原代HSCs活化过程中，KDM4水平逐渐降低。敲除KDM4能加速HSCs活化，同时miR-29水平明显降低。进一步研究显示，KDM4与SREBP2结合促进miR-29，从而抑制HSCs活化。

Wang等[14]深入研究了miR-29a在HSCs活化及肝纤维化进程中的作用。研究者构建了miR-29a转基因小鼠，结果显示，与正常小鼠相比，miR-29a转基因小鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMΑ)明显减弱。在胆道结扎小鼠模型(bile duct-ligation,BDL),过表达miR-29a后小鼠肝纤维化减弱，伴随着肝组织BRD4(bromodomain-4 protein)表达下降。过表达miR-29a后，HSCs增殖和迁移能力明显下降，同时BRD4和EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)表达减弱。据此，miR-29a通过下调BRD4活性，发挥抗纤维化作用。miR-29a类似物或可成为治疗肝纤维化的新疗法。

(三)miR-9 新近发现miR-9与纤维化关系密切。Han等[15]深入探索了miR-9在肺纤维化中的作用机制。研究人员发现，人体纤维化肺组织NEAT1表达高于正常组织，而miR-9水平低于正常肺组织，两者呈负相关。在细胞实验中，TGF-β1刺激下人肺腺癌细胞A549及人支气管上皮细胞活化，高表达NEAT1、胶原纤维Ⅰ(Collagen Ⅰ)、胶原纤维Ⅲ(Collagen Ⅲ)和α-SMA，而miR-9水平明显降低，敲除NEAT1或过表达miR-9均可逆转这种效应，提示NEAT1可与miR-9结合，抑制miR-9活性，促进纤维化进展。在博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化小鼠模型中，肺组织纤维化分级明显高于正常小鼠，敲除小鼠NEAT1后，肺纤维化分级明显降低，这说明NEAT1/miR-9能在肺纤维化进展中发挥重要作用。

Tu等[16]探索了miR-9-3p在肝病发病机制中的作用。结果显示，miR-9-3p在肝癌组织中的水平明显低于正常肝组织，高表达miR-9-3p后，肝癌细胞迁移及侵袭能力明显下降，说明miR-9-3p在肝病中发挥重要作用。Fu等[17]深入探索了miR-9与肝纤维化的关系，结果表明，在人体肝组织中，随着纤维化分级升高，多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达增强，而miR-9水平降低。在星状细胞活化过程中，可观察到类似趋势。miR-9能明显降低HSCs的增殖活性，减少细胞外基质的表达，抑制miR-9活性能逆转这种效应。深入研究显示，miR-9能与MRP1结合，抑制MRP1表达及Hedgehog信号通路活性，发挥抗纤维化效应，这也在进一步的动物实验中得以证实。Dong等[18]研究表明，miR-9-5p可通过调节TGF-β受体1(TGFBR1)和TGF-β受体2(TGFBR2)抑制TGF-β1途径的HSC活化。以上研究均表明miRNA-9具有抗肝纤维化的潜力。

二、促进肝纤维化的miRNA

(一)miR-942 miR-942是近年来发现的与肝癌细胞相关的一种新的miRNA，Zhang等[19]研究显示，抑制miR-942水平后，肝癌细胞的迁移、侵袭及糖酵解能力明显下降；circ_0001445(一种Circular RNA)能显著抑制miR-942活性，从而延缓肝癌进展。Liu等[20]研究显示，活化HSCs高表达miR-942；且在HBV患者中，随着纤维化分级的升高，miR-942水平增加，提示miR-942可以作为一种生物标志物来评估肝纤维化的分级。

PPARγ在静息的HSCs中表达丰富，抑制PPARγ的表达可以促进HSCs的激活。PPARγ激动剂能抑制HSC表达α平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)和胶原纤维COL1A2。Tao等[21]研究证实，PPARγ水平随着肝纤维化分期的增加而降低，并且与慢性乙型肝炎患者肝组织纤维化分级和HSC中α-SMA的表达呈负相关。同时发现PPARγ3′UTR是miR-942的作用靶点，miR-942的过表达可以抑制PPARγ，而敲除miR-942可促进PPARγ的表达。所以，miR-942通过抑制PPARγ促进HSC活化，可能成为未来肝纤维化的重要治疗靶点。

(二)miR-212 TGF β/Smads 信号通路在肝纤维化中起着至关重要的作用。TGF-β1是重要的促纤维化细胞因子,它促进静息HSCs活化并分泌大量的ECM,这是肝纤维化的关键机制。TGF-β1家族成员通过连接细胞膜受体(I 型和 II型)来传导信号通路。TGF-β1连接受体后激活下游SMAD2 和 SMAD3以及SMAD4,这是一个稳定而复杂的磷酸化过程。SMAD7 是 TGF-β1信号通路抑制剂,可与活化型 I 受体结合,阻断 SMAD2/3 的磷酸化，它也可以联合泛素 E3 连接酶,使TGF β1受体 I泛素化和降解。在体内，肝细胞特异 SMAD7 减少可激活TGF β并介导纤维化形成。

Zhu等[22]在体外实验中证实，miR-212可以通过活化 TGF β1信号通路来诱导 HSC 的活化,上调α-SMA和collagen在HSC的表达。而且，miR-212 可以直接作用于SMAD7，抑制SMAD7 的 mRNA 和蛋白质表达。这说明miR-212可以通过SMAD7靶向调节TGF-β1信号通路促进HSCs活化。因此，miR-212亦有望成为新的肝纤维化标志物及治疗靶点。

(三)miR-200c miR-200系列，包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等，其中miR-200a表达上调可抑制TGF-β1诱导的HSC活化和增殖，miR-200b的上调通过PI3K/Akt信号通路刺激HSCs的增殖和迁移，然而，很少有报道提到miR-200c在HSC激活和肝纤维化中的作用。

为了探究miR-200c在人(HSC)肝星状细胞活化和肝纤维化进展中的作用，Ma等[23]开展了相关研究，其实验数据表明，miR-200c高表达可以上调HSCα-平滑肌肌动蛋白(SMA)、波形蛋白、I型胶原蛋白和表皮生长因子(EGF)的表达，同时，miR-200c可能通过下调FOG2蛋白表达促进PI3K/Akt信号活化，从而激活HSC，诱导肝纤维化形成。因此，miR-200c是 HSCs活性、增殖和迁移的重要促进因素,在肝纤维化中具有非常重要的作用。miR-200c可能是HSC活化和肝纤维化进展的潜在标志物，甚至是治疗肝纤维化的潜在靶点。

总之，肝纤维化的机制非常复杂，在外源性因素的刺激下，静息HSC被激活，转化为肌成纤维细胞，并分泌出ECM，最终导致肝纤维化。一些研究表明，肝纤维化的发生、发展与众多信号通路有关，包括MAPK信号通路、NF-κB信号通路、TGFβ/Smad等[24-25]。miRNA 是人体中一类基因表达调控因子，它可以通过靶向调节肝纤维化相关信号通路调控肝星状细胞活性，从而发挥促纤维化或抗纤维化作用。尽管目前证实miRNA在肝纤维化病理过程中作用机制的发挥了重要作用，但我们对miRNA的认识仍非常有限，需要进一步研究来明确其调控肝纤维化进展的机制。更重要的是，随着临床研究的广泛开展，会发现越来越多的miRNA的肝纤维化诊断价值，其具有重要的临床意义。