Eya家族蛋白在恶性肿瘤中的研究进展

杨俊美 王彩霞

佳木斯大学附属第一医院,黑龙江省佳木斯市 154000

Eya家族是重要的发育基因，首先在果蝇视网膜的发育过程中发现，参与人体多个器官的发育，在发育后表达下调，该家族基因主要有Eya1、Eya2、Eya3、Eya4。发育基因的功能异常是肿瘤发生的常见原因，也是许多肿瘤发生和发展中的普遍现象[1]。近年来Eya蛋白在许多肿瘤中均有研究，但表达情况不尽一致，本文旨在总结Eya家族蛋白在多种肿瘤中的表达情况及研究进展。

1 Eya家族蛋白的结构和功能

最初认为Eya是调控果蝇眼睛发育的关键基因，首先认识它是因为其对果蝇眼睛形成的重要作用和影响，其参与人体多个器官的发育过程，Eya1和Eya2在器官发育过程中广泛表达于头颅、胎盘、鳃弓和中枢神经系统。Eya3在鳃弓和中枢神经系统有表达，但是在头颅、胎盘无表达，Eya4参与包括胸腺、甲状腺、甲状旁腺的发育，Eya1、Eya2和Eya3也参与眼睛的发育,Eya1表达于前房，Eya2表达于视网膜、巩膜和视神经鞘，Ramos S等[2]研究Eya在具有分生组织卵巢的黑腹金丝猴的作用中，指出Eya也参与昆虫的卵子发生，而且Eya突变阻碍了性腺的形成。Eya家族蛋白是从水生到人类的保守蛋白质，包含271个残基的氨基末端区域和274个残基的保守的羧基末端区域，称为Eya结构域(ED)是保障其功能的重要结构,Eya的氨基末端有苏氨酸磷酸酶，羧基末端有卤酸脱卤酶结构域，含有酪氨酸磷酸酶(Thr)。Eya基因具有调节细胞死亡和/或分化的作用，是视网膜决定基因网络(RDGN)的重要成员之一，该基因网络主要有Dach、Six和Eya，Dach作为肿瘤抑制因子，而Six和Eya作为癌基因发挥作用。在生物体中，Eya蛋白不仅是磷酸酶，还充当转录因子的角色，具有帮助同源盒家族基因Six转录的功能，Six缺乏内在转录活性区域，需要与Eya共同和结合形成转录复合体，来促进转录，在多个器官发育中起重要的作用。

功能上，Eya蛋白属于核转录因子网络成员之一。 Eya作为转录因子和转录激活因子可以与Six结合，与Six结合后可增加肿瘤干细胞(CSC)的数量，并诱导上皮—间充质转化(EMT)。在Zhou Hengbo等[3]的研究中发现这种作用是通过激活转化生长因子-β信号通路实现的。曾有学者认为，Eya家族蛋白的致瘤原因与血管的新生有关，具体如下：组蛋白H2A是核小体的亚基，核小体包含145bpDNA和八个组蛋白，两个H2A，H2B，H3和H4，H2AX是几乎所有真核生物均存在的一种组蛋白变体，DNA在正常情况下被包裹在组蛋白内，当致癌等损伤因素导致DNA损伤时，H2AX被磷酸化，产生γ-H2AX。磷酸化的H2AX是DNA双链断裂的证据，DNA损伤反应(DDR)是一种重要的细胞保护机制。DNA的错误修复会导致整个基因组的不稳定和癌症的发生。DNA双链损伤时，H2AX被磷酸化，募集MDC1, MDC1作为一个对接平台，促进其他因子在DNA双链损伤位点的聚集,DNA损伤后，MDC1把ATM依赖的ZNF506(辛指蛋白506)定位到病灶，ZNF506进而招募蛋白磷酸酶 Eya，导致H2AX在Y142处去磷酸化，进一步促进MDC1等下游修复因子的招募。Eya蛋白可以使H2AX的末端酪氨酸残基去磷酸化的作用，产生高效DNA修复复合物，DNA损伤修复(DDR)可在有害的微环境中使内皮细胞存活，从而促进病理性血管生成。近年来，Eya家族蛋白在多种肿瘤中均有研究。

2 Eya蛋白在多种恶性肿瘤中起促癌作用

2.1 Eya1在肝细胞癌中的研究 肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大常见原因，大量研究表明，乙型肝炎病毒及其产物、HBV整合、变异均可诱发肝细胞癌，肝细胞癌的诊断仍然对临床医生具有挑战性，特别是对于甲胎蛋白低的患者，所以寻找新的有效标志物及治疗靶点是极其迫切的。有研究表明Eya1可以促进肝细胞癌的转移和侵袭，且与上皮间质转换有关。

Eya1与含3B的纤连蛋白Ⅲ型结构域(FNDC3B)配位，FNDC3B也称为FAD104(脂肪细胞分化因子104)，通过调节细胞粘附、生长和迁移，参与脂肪细胞和成骨细胞的分化和肺的成熟，Kong Deguang等人[4]Eya1在肝细胞癌研究中，通过Western blot分析表明，Eya1不仅增加了FNDC3B的丰度，而且促进了上皮间质转化(EMT)样表型的改变，如增加N-钙粘蛋白和减少E-钙粘蛋白的表达。提示Eya1激活FNDC3B促进肝癌细胞的迁移和侵袭。FNDC3B被鉴定为Eya1的一个新的下游靶点，这些发现为肝细胞癌新的肿瘤标志物的研究和癌细胞癌的治疗又提供的新的理论线索。然而，有学者研究Eya4在肝细胞癌中的作用与Eya1的作用相反，Zhu Xiao-Xu等[5]研究Eya4在肝细胞癌中抑制肿瘤细胞的生长，并与MYCBP蛋白呈负相关，MYCBP是一种11-kDa蛋白，可与MYC结合并刺激转录的激活。MYC表达的增加可以促进MYCBP在细胞周期的S期易位到细胞核中，并影响细胞的增殖、分化和凋亡。他们认为，Eya4通过抑制MYCBP进而抑制肝细胞癌细胞系中的细胞增殖并诱导G2/M阻滞, Eya4通过在Ser552上对β-连环蛋白(β-catenin)进行磷酸化来减少β-catenin的核易位，从而抑制了β-catenin/ LEF1与MYCBP启动子结合引起的MYCBP转录,在肝细胞癌中起抑癌作用。

2.2 Eya1在甲状腺乳头状癌中的研究 甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是起源于滤泡上皮的恶性肿瘤,Kong Deguang等人[6]研究发现，在甲状腺乳头状癌组织芯片中，Eya1与Six1密切相关，功能分析表明，Six1通过将Eya1稳定在转录后水平进而增加了Eya1的表达，并且两者在PTC中的高表达与高龄、淋巴结转移和临床分期有关，Six1依赖Eya1诱导转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcriptinon3,STAT3)信号系统,而已知STAT3在多种肿瘤中作为癌基因起作用，促进肿瘤的进展。

2.3 Eya2在前列腺癌中的表达 前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性第二常见的癌症，是威胁全世界男性健康的重要肿瘤之一。Liu Zhongyuan等人[7]研究表明，Eya2 mRNA与前列腺癌的Gleason评分和淋巴结转移呈正相关，并且Eya2降低了前列腺癌患者对多西他赛的敏感性和多西他赛诱导的细胞凋亡。Eya2的过表达上调了Bcl-2，基质金属蛋白酶7(MMP7)和AKT磷酸化， Eya2可能通过AKT/Bcl-2轴调多西他赛的敏感性和线粒体膜电位，从而促进细胞增殖和侵袭以及癌症的进展。

2.4 Eya2在人脑星形细胞瘤中的作用 星形细胞瘤是起源于神经上皮的恶性肿瘤，是神经系统较为常见的肿瘤，其易复发，预后差[8]，Wen Zhifeng等人[9]研究Eya2在星形细胞瘤中的作用时认为Eya2在Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤(Astrocytoma)中的表达率高于Ⅰ～Ⅱ级。另外，将Eya2表达质粒转染Eya2低表达的细胞系，发现其促进了细胞周期的进程，而Eya2的敲除抑制了细胞周期进程，并伴随着细胞周期相关蛋白表达的变化，包括细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白E(cyclin E)。Eya2还正向调节细胞外信号调节激酶(ERK)活性和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。另外，使用抑制剂阻断ERK信号，取消了Eya2对A172细胞侵袭和MMP9产生的影响。他们认为Eya2可能通过调节ERK信号通路，调节星形细胞瘤细胞的增殖和侵袭。

2.5 Eya2在人类乳腺癌中的研究 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在乳腺癌中的Eya蛋白的研究中，Fu Jing等人[10]研究发现Eya2与microRNA相关，miR-30a通过与Eya2的30个非翻译区结合来抑制Eya2的表达，Eya2可以增加c-Myc、cyclin A、cyclin D1和cyclin E的表达,他们发现miR-30a可以通过抑制Eya2的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。乳腺癌患者miR-30a表达下调，与乳腺癌患者Eya2表达呈负相关。众所周知，表皮生长因子受体(EGFR)是调节肿瘤细胞生长、侵袭和转移的重要调节因子，研究表明，Eya2是EGFR的下游调节器，具体通过缺氧诱导因子(HIF1α)下调肿瘤抑制因子micoRNA-338-3p(miR-338-3p)和激活Eya2蛋白来促进乳腺肿瘤的生长和转移。

2.6 Eya2在人类肺癌中的研究 肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管在诊断和治疗策略方面取得了进展，但肺癌的预后仍然很差。研究表明，Eya2通过调节miR-93来抑制磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN)的表达，从而促进细胞增殖，且与预后较差相关。Anantharajan J等人[11]利用基因突变证明，肺腺癌细胞的迁移、侵袭形成和侵袭依赖于Eya2酪氨酸磷酸酶的活性，而生长和存活则与Eya2酪氨酸磷酸酶活性无关。Yuan Yuncang等人[12]研究发现miR-30a在肺腺癌A549细胞中的过表达抑制了细胞的迁移和侵袭，但对细胞增殖和细胞周期进程没有影响，并通过双荧光素酶报告实验证明Eya2是miR-30a的直接靶点，两者表达呈负相关,这与Fu Jing等人在乳腺中研究的Eya2和miR-30a的关系结果相似。

2.7 Eya2在人类骨肉瘤中的研究 骨肉瘤是一种由产生类骨质和未成熟骨的间充质细胞组成的恶性骨肿瘤。骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，其好发年龄段为15～19岁，病灶多位于长管状骨的干骺端，转移率及致死率均较高。有学者通过生物信息学分析预测和双重荧光素酶报告基因分析表明miR-219a-5p可以在其30 UTR处结合Eya2，显著抑制了Eya2的表达。使用Transwell入侵测定法和刮擦伤口愈合测定法，沉默骨肉瘤细胞中的miR-219a-5p可以显著诱导肿瘤细胞的侵袭和迁移，Eya2的下调逆转了miR-219a-5p抑制剂对细胞侵袭和迁移的影响。他们的研究表明Eya2在骨肉瘤中表达上调，并且miR-219a-5p通过抑制Eya2表达来调节肿瘤细胞对OS细胞的侵袭性[13]。

2.8 Eya3在乳腺癌中的研究 在Vartuli RL等[14]的实验中，Eya3的缺失降低了免疫活性小鼠的肿瘤生长，并且伴随CD8+T细胞数量的增加，他们认为Eya3利用其Thr磷酸酶活性在pT58处去磷酸化MYC，从而使其形成稳定的形式,促进肿瘤的进展。而且，稳定的MYC使程序性死亡配体1(Programmed cell deth protein,PDL-1)在肿瘤的作用增强。而癌细胞可以利用PDL-1和程序性死亡分子(Programmed deth1，PD-1)使肿瘤细胞免受免疫系统的攻击[15]。

3 Eya家族蛋白在部分肿瘤中出现低表达

3.1 Eya2在大肠癌中的研究 结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列，且呈现出上升趋势。郑杰等人[16]在包括922例大肠癌病例的大队列中评估了Eya2表达在大肠癌发生发展中的意义。采用免疫组织化学方法检测大肠组织中Eya2蛋白的表达。研究Eya2在肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达与大肠癌发生的关系。采用Kaplan-Meier和Cox模型分析影响大肠癌预后的因素。结果显示Eya2在癌旁正常组织、腺瘤、原发肿瘤和转移性大肠癌中的表达逐渐降低(均P<0.05)。他们认为在大肠癌组织中Eya2的表达普遍降低,Eya2高表达预示大肠癌预后较好。

3.2 Eya4在胰腺导管癌及食道癌中的研究 Mo Shi-Jing等人[17]在Eya4在胰腺导管癌(Pancreatic ductal adenocarci-noma，PDAC)的研究中，在PDAC细胞中过表达Eya2，在体外抑制了肿瘤的增殖和侵袭，在体内抑制了肿瘤的生长。PDAC细胞中Eya4的缺失在体外可促进肿瘤的增殖和侵袭，在体内可促进肿瘤的生长。机制上，Eya4通过丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶活性，使β-catenin在Ser675位去磷酸化，阻断β-catenin核转位，抑制Id2反式激活。有学者研究Eya蛋白在肿瘤中呈现低表达时由于其在肿瘤中呈现甲基化的状态，而DNA甲基化是常见的一种表观遗传学状态，在多种肿瘤中均有发生。Luo Mei等[18]关于Eya4的研究中发现，Eya2在大多数食管癌细胞系中呈低表达和高甲基化(85.7%，6/7)的状态。他们用小发夹RNA敲除Eya4增加了肿瘤细胞体外迁移和侵袭的能力。曾有报道指出，在结肠癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤中存在Eya4临近启动子甲基化的现象，而在正常胃黏膜、食管中未出现Eya4甲基化现象。

4 总结与展望

综上所述，Eya家族蛋白在肿瘤的作用复杂，在大部分肿瘤中呈高表达的状态，与上皮间质转化、肿瘤性血管生成、基质金属蛋白酶、CD8+T细胞的数量及稳定细胞周期蛋白有关，促进了肿瘤细胞的侵袭与迁移，但在某些肿瘤中存在甲基化的现象，在肿瘤中表达降低，该家族成员在肿瘤中的重要作用有望对肿瘤的治疗提供新的线索，为更多肿瘤患者谋福利。