供体基因变异与移植后血栓形成研究进展

李姗霓，高伟，沈中阳（天津市第一中心医院器官移植中心，天津 300192 ）

移植后血栓主要包括肝动脉血栓形成（hepatic artery thrombosis，HAT）和门静脉血栓形成（portal vein thrombosis ，PVT），还有其他术后血管并发症，如肺栓塞（pulmonary embolism，PE）、深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）、心脑血管梗死和其他静脉血栓形成。移植后血栓形成是肝移植术后严重的并发症［1-2］，可以明确地减少移植物和受者的生存期［3］，在儿童和成人的队列研究发病率高达26%［4］，大约16%的移植物失功与血栓形成相关。移植后血栓形成的临床技术危险因素已经在多方面得到研究和验证，但是关于供体基因的危险因素研究少有报道。本文将近年这一领域的研究进展进行总结归纳如下。

1 基因变异与血栓性疾病

为了解静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的遗传学机制，Lindström 等［5］进行了VTE的 全 基 因 组 关 联 研 究（genome-wide association studies，GWAS）和基于全血和肝脏基因表达的全转录组关联研究（tranome-wide association study，TWAS）。他们对来自18 项研究的30 234 例VTE 病例和172 122 例对照组的GWAS 数据进行了荟萃分析，并评估了12 923 718 个基因变异与VTE 之间的关联。确定了16 个新的静脉血栓栓塞易感位点，他们从全血和肝组织中产生基因表达的变异预测分数，并评估他们与VTE 的相关性。孟德尔随机分析了遗传相关的性状与新的VTE 基因座。从GWAS荟萃分析中鉴定出34 个独立的VTE 风险遗传信号，其中14 个是新近报道的关联基因。这包括11个新的相关基因座（C1orf198、PLEK、OSMR-AS1、NUGGC/SCARA5、GRK5、MPHOSPH9、ARID4A、PLCG2、SMG6、EIF5A 和STX10），3 个 已 知 基因的3 个新的独立信号。此外，TWAS 在全血（SH2B3、SPSB1、RP11-747H7.3、RP4-737E23.2）和肝脏（ERAP1）中鉴定出以上5 个额外的基因位点，其插补基因表达水平在病例和对照组之间存在差异。

Lindström 等［5］也 进 行 了GWAS 的荟 萃 分 析，以 确 定VTE 易 感 基 因。12 个GWAS 共7 507 例VTE 病例受试者和52 632 例对照受试者组成了队列研究，其中6751884 个VTE 相关单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）被测试。发现9 个基因座达到5×10-8的全基因组显著性水平，包括6 个已知与VTE 相关的基因座（ABO、F2、F5、F11、FGG 和prorc）和3 个未被发现的基因座。这一方法识别出两个VTE 相关基因座TSPAN15和SLC44A2 的 复 制。SPAN15 位 点 的SNPs 导 联是内含子rs78707713，SLC44A2 导联是非同义的rs2288904，其先前显示与输血相关的急性肺损伤相关。TSPAN15 和SLC44A2 不属于血栓形成的常规途径，也不与其他心血管疾病或相关的定量生物标志物相关。这一发现揭示了VTE 病因的意外因素，并为VTE 病理生理学的新机制概念铺平了道路。

为了深入了解血栓性疾病的遗传调控，Hinds等［6］进行的一项GWAS，研究对象为6 135 例血栓患者和252 827 例欧洲健康对照人群。他们发现8 个基因座超过全基因组显著性。其中有F5、FGAFGG、F11、F2、PRORC 和ABO 基因附近这些先前已知的静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）基因座有复制，以及最近发现的SLC44A2 附近的基因座复制具有显著差异性。此外，他们的研究首次报告了rs114209171，它位于F8 结构基因上游，与血栓形成风险有关。对不同组织的表达谱和表达数量性状基因座的分析表明，SLC44A2、ILF3和AP1M2 是19 号染色体基因座的3 个最可能的候选基因，这是唯一一个全基因组范围内没有凝血相关基因的重要血栓形成相关基因座。提供的数据显示，这个位点也作为脑卒中和冠心病（coronary artery disease，CAD）的一个新的危险因素。这一观察结果为更大规模的荟萃分析开辟了可能性，这将有助于阐明血栓性疾病的遗传学，并为其他疾病的遗传学研究提供了一个范例。

UK biobank 是世界上最大的欧洲个体表型和基因型信息库。Klarin 等［7］基于这一数据库信息对10 个VTE 相关变异体的遗传风险评分进行的一项表型广泛关联研究时使用的也是F5、F2、ABO、F11 和FGG 这些先前报告的VTE 相关位点。他们鉴定出1 个新的基因座ZFPM2 rs4602861，具有全基因组显著性（优势比1.11；95%置信区间为1.07 ～1.15；P ＝4.9×10-10），F2 位点有一个新的独立变异体（rs3136516；优势比1.10；95%置信区间为1.06 ～1.13；P ＝7.60×10-9）。

GWAS 发现了导致不同程度VTE 风险增加的常见遗传变异。抗凝基因PROC、PROS1 和SERPINC1的罕见突变导致纯合子围产期致命血栓形成，并显著增加杂合子VTE 的风险。然而，目前所描述的静脉血栓栓塞变异占风险的比例不足以常规用于临床决策。为了确定新的罕见VTE 风险变异体，Desch 等［8］对393 例无原因VTE 患者和6114 例对照者进行了完整的全外显子组测序鉴定。这项研究发现4 个基因在VTE 患者中含有过多的罕见破坏性变体：PROS1、STAB2、PROC 和SERPINC1。在STAB2，7.8%的VTE 病例和2.4%的对照组有一个合格的罕见变异。在细胞培养中，与STAB2 相比，与VTE 相关的STAB2 变体的表面表达减少。STAB2中的常见变异先前与GWAS 中的血浆血管性血友病因子和凝血因子Ⅷ水平相关，表明stabilin-2 的单倍体不足可能通过这些促凝剂水平的升高而增加VTE的风险。在一个独立的队列中，他们发现与对照组相比，STAB2 罕见变异个体的血管性血友病因子水平和相应的前肽水平更高。

Klarin 等［9］进行了100 万例GWAS 以及测试了约1 300 万个与静脉血栓栓塞相关的DNA 序列变体（26 066 例和624 053 例对照），并对这两项研究进行了荟萃分析，随后进行了多达17 672 例静脉血栓栓塞病例和167 295 例对照组人群的独立研究。他们确定了22 个以前未知的位点，使静脉血栓栓塞相关位点的总数达到33 个，并随后对这些位点进行了精细定位。他们建立了一个静脉血栓栓塞的全基因组多基因风险评分，该评分确定了5%的人群具有与已知血栓风险因子V Leiden p.R506Q 和凝血酶原G20210A 突变同样的血栓发生风险。

Morange 等［10］记录了静脉血栓形成（venous thrombosis，VT）的基因决定因素，并更新了高通量基因分型和测序技术应用的最新发现。17 个基因已被证实含有与VT 风险相关的遗传变异：ABO、F2、F5、F9、F11、FGG、GP6、KNG1、PROC、PROC、PROS1、SERPINC1、SLC44A2、STXBP5、THBD、TSPAN15 和VWF。常见的多态性仅占VT 遗传性的一小部分（约5%）。

除凝血因子V（F5）单核苷酸多态性外，序列相似性家族134 成员B（FAM134B；rs78314670，Arg127Cys） 和 肌 球 蛋 白 重 链8（MYH8；rs111567318，Glu1838Ala）SNPs 与复发性室性心动过速相关（n ＝34）（假发现率校正P ＜0.05）［11］。

2 供者基因变异与移植后血栓形成

移植前凝血异常可以通过供器官移入受者体内，同时增加供受者出血和血栓风险。Ali 等［12］对活体肝移植供者的凝血和血栓因子进行了系统筛查，检测了因子VLeiden，凝血酶原G20210A 和MTHFR 基因C667T 突变。发现供者有轻度凝血异常时，移植后血栓和出血风险都会显著增加。供者有中度凝血异常也会引起移植术中大出血。有血栓性缺陷的患者可能在术后早期发生静脉血栓。

来源于供肝凝血路径的遗传性基因变异会通过手术移植入受者体内，这是不可避免的，再加之终末期肝病患者自身移植术前的血液高凝状态与来源于供肝的获得性遗传基因变异风险因素相结合，就会导致移植血栓风险进一步增加［13］。

既 往 研 究 报 道 供 肝 中 的 V Leiden 或 因 子ⅩⅢG100T 与移植后HAT 相关［14］。一项研究报告了一例肝移植后HAT 患者的原肝和供肝均出现杂合子FVL［15］。有些报道称由于供肝FVL 突变而获得的活化蛋白C 抵抗，导致移植后血栓并发症［16］。最近一项584例的病例报道称428例中有33例 （8%）病例因为血管并发症原因被排除入组，主要是血栓问题。有趣的是，同样一项关于156 例活体肝移植的研究中有13 例发生血栓，但没有1 例进展为血管并发症［17］。

Li 等［18］对供体血栓性基因的遗传变异与移植后血栓形成的风险增进行了全基因组关联研究。他们对1993 年— 2018 年间接受肝移植的775 例成人和310 例儿童的供者全部进行了基因分型，来分析供者的已知的血栓相关基因变异对移植后血栓形成的影响。此外，他们还对上述1085 例肝移植进行了GWAS 和荟萃分析。在供体队列中，已知的血栓风险位点与移植后血栓形成无关，这表明不需要基于血栓易感多态性来排除肝脏供者。通过这一项儿童和成人的荟萃GWAS 分析研究，他们在预示遗传意义阈值的55 个位点中确定了280 个变异，下游优先策略识别生物学上可信的候选基因，其中AK4（rs11208611-T，P ＝4.22×10-5），该蛋白编码一种调节细胞ATP 水平的蛋白质，并抑制 AMPK 和mTOR 的电流激活，另一个是RGS5 （rs10917696-C，P ＝2.62×10-5），它参与了血管的发育。他们提供的证据表明，这些供者遗传变异之前没有被证实与血栓性疾病相关，恰恰说明这些是肝移植后血栓形成风险增加相关的特有遗传变异。

之后的GWAS 对基因变异与静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE） 风 险 增 加 的相关性进行分析。这些研究一致地确定了编码因子V Leiden（F5）、ABO、F11、FGG、F2、 蛋 白C（PROC）、PROS1、SERPINC1、STAB2、ZFPM2、TSPAN15、SLC44A2、prorc、STXBP5 和F Ⅷ 的基因与SNPs 的关联，这引起了人们对遗传学在肝移植后血栓形成中的作用的兴趣。因此如果没有对供者进行全基因组学分析，就会导致供体遗传学在肝移植术后血栓形成中的真正作用认知有限。

为了评估了供体中已知的血栓基因变异对移植后血栓形成的影响，他们用全基因组芯片检测供体常见血栓基因变异与移植后静脉血栓的相关性，然后整合了关于组织特异性表达、共表达、已确定候选基因疾病关联的公开获取数据，对这些基因的可能致病机制进行了深入分析。为了阐明血栓形成与遗传风险之间的相关性，他们报告了OLT 后血栓形成的危险因素和增加的风险奇数比率（odd ratios，ORs）和所选风险变量的统计值，或连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）高水平的代用变体，还进行了12 项基于基因的测试来研究已知的血栓相关基因对肝移植术后血栓风险的影响。基于文献，他们检测了以下血栓相关基因：ABO、F5、F2、FGG、F11、PROC、STAB2、ZFPM2、TSPAN15、SLC44A2、PROCR 和STXBP5， 即之前报道过的VTE 相关基因，他们分析了每个基因100 kb 范围内的所有变体，并分析了这些变异与肝移植术后血栓形成的关系。

通过已知的VTE 基因研究观察供者基因变异体的影响，检测到163 个相关的变体或代理变体proxy variants。在候选基因中，其中一个变体（rs1336472-G）超过了Bonferroni 校正值3.1×104与SNP×SNP 相互作用。Bonferroni 校正后，没有一个独立的变异与移植后血栓形成风险有显著关联。为了评估OLT 队列中先前报道的血栓形成风险基因的患病率和影响，检测了含有12 个已建立的血栓相关基因（ABO，F5，F2，FGG，F11，PROC，STAB2，ZFPM2，TSPAN15，SLC44A2，PROCR，and STXBP5），发现血栓危险基因区共检测到65 个位点，其中，没有一个变种超过Bonferroni 校正7.7 ×104，这表明这些血栓形成相关基因不能被用作普遍的基因风险标志来预测移植后血栓风险。 为了探讨已经建立的VTE 风险变体的影响，对捐献者队列进行了PRS 分析，也没有发现统计学差异。

2.1 全基因组与移植后血栓形成：根据供者基因型用GWAS 荟萃分析对106 例成人和儿童病例进行了分析。这些分析基于500 万个基因变异使用1 kg 参考面板进行基因分型或插补，并通过了广泛的质量控制。分析分为3 个阶段进行：第一阶段儿童原位肝移植队列（42 例与268 个对照组）；第二阶段成人OLT 队列研究（64 例与711 例对照组）；第三阶段联合荟萃分析。在主要荟萃GWAS 中，鉴定了280 个基因变异具备显著性，共有55 个位点（表S5）。Genomic inflation factor （λGC）基 因 组 膨 胀 因 子是0.988，对儿童和成人GWAS 结果显著不同的变异进行筛选后，得到40 个基因loci 儿童和成人队列两组间一致（两组均P ＜0.05）。这40 种遗传风险基因变异解释了29%的移植后血栓形成。对供体吸烟和血管重建的校正并未改变分析结果。

2.2 移植后血栓亚群的遗传关联：为了说明血栓形成的合理性和有效性结果，再次检查了3 种生物学上由所有血栓性亚群驱动最可能的变异（rs11208611、rs10917696 和rs1965492）。我们对血栓形成亚组进行了遗传关联分析，包括HAT、PVT和其他血栓形成，随后进行荟萃分析3 个血栓亚组。比较各血栓亚组rs11208611、rs10917696 和rs1965492 的关联结果，发现rs10917696 主要由HAT（P ＝1.54×10-4） 和其他血栓驱动（P ＝2.68×10-3）。为了说明PRS 对不同血栓亚群和短期生存率的影响，再用荟萃GWAS 比较HAT 和PVT 亚群的PRS计算结果显示在HAT 和PVT 之间PRS 无显著性差异，这说明了供者基因因素会导致所有血栓，结果不是有HAT、PVT 或其他血栓驱动的。此外，根据血栓性事件计算的PRS 是短期移植物衰竭的患者更高（P ＝7.8×10-6）［19］。

总之，供肝中既往报道的血栓性基因变异在他们的移植供受者研究队列中，没有显著增加OLT 后血栓形成的风险。新发现了3 个新的候选基因与移植后血栓形成有关［19］。首先是AK4 （rs11208611-T，P ＝4.22×10-5），这是一个高度保守的基因，编码许多腺苷酸激酶。这种酶富含在组织中，在大脑、心脏、肾脏和肝脏线粒体中表达，它通过与ADP/ATP 易位酶的相互作用间接调节线粒体膜的通透性，44AK4 通过磷酸化和调控细胞ATP 水平发挥作用AMPKα2 可能影响Fyn 磷酸化，而Fyn 磷酸化在血小板α Ⅱbβ3 整合素信号转导中起关键作用，导致血栓收缩和血栓稳定。重要的是，该变异在高LD和重复的VTE 相关变异（rs1336472）中，AK4 之前曾被报道为发生VTE 的风险基因。第二个候选基因是RGS5，它编码G 蛋白信号传导（RGS）家族的一个调控成员，RGS 蛋白是一种信号转导分子，它参与了免疫球蛋白的形成通过作为GTPase 活化调控异三聚体G 蛋白。RGS5 被报道为调控血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）的增加重建侧支动脉。它已被确定为血管重塑的关键调控因子，但尚未在任何血栓栓塞 GWAS 中报道。第三个被识别的基因是ETFA，编码线粒体脂肪酸-氧化中的一个电子受体。ETFA 与给定的“动脉或静脉血栓形成”表型相关，并且是正常线粒体脂肪酸氧化和氨基酸代谢所需。

关于供者基因变异与移植后血栓形成的相关研究还有待进一步深入，这将有助于扩大肝脏捐献者范围，有效预防术后并发症。