单细胞测序技术在头颈部恶性肿瘤中的研究与发展

范琳 田霖丽 综述 刘鸣 审校

自2009年单细胞测序技术问世以来，研究人员通过对单个细胞的遗传信息进行测序，检测出个体细胞间的差异和他们在微环境中的相互作用机制及某一特定细胞的发生发展过程。目前，头颈部恶性肿瘤已经成为癌症相关疾病死亡的第六大病因，但基于免疫组化、解剖部位和肿瘤分期的肿瘤分类方法并没有将肿瘤异质性的因素考虑在内，基于这种分类方式制定的临床诊疗方案仍有待进一步探索。随着单细胞测序技术的开展，推动研究人员对头颈部恶性肿瘤的发生机制和个体化治疗方案的制定进行更全面、精确的研究。本文就单细胞测序在头颈部恶性肿瘤中的研究进展予以综述，旨在探寻该技术在头颈部恶性肿瘤的基础研究及诊治方面可能带来的重要变革。

1 单细胞测序概述

单细胞测序技术是通过对分离的单个细胞进行基因组的扩增，从而进一步进行测序、分析和应用。单细胞测序技术包括单细胞单组学分析和单细胞多组学分析，其中单细胞单组学分析包括基因组测序、转录组测序、表观遗传组测序和蛋白质组测序[1]。单细胞基因组测序可以应用于检测基因组的稳定性和基因组的变异[2]，从而为人类理解细胞的生理和病理功能提供新见解。转录组测序技术为描述肿瘤细胞的克隆多样性和探究罕见细胞在肿瘤发展中的作用提供了强有力的新途径[3]。表观遗传是指基因组和转录组以外可遗传的信息，如DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白修饰、染色质的重塑和三维空间构象等。单细胞表观遗传学测序技术的产生让研究人员对表观遗传学的关键问题得以进一步研究，如细胞的转录异质性是否与表观遗传异质性有关。蛋白质组学技术的出现对了解单细胞中的蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用十分重要。单细胞多组学测序技术的发明有助于探究基因组、转录组、表观遗传组的相互作用关系[4]。总之，单细胞测序技术使研究者能够低成本、快速构建器官或者组织的大规模单细胞表达图谱，了解组织或器官内细胞复杂的基因网络，以及单细胞中的调控机制，进一步探究各细胞群体的协同方式。

2 单细胞测序在头颈部恶性肿瘤中的研究进展

2.1 揭示头颈部恶性肿瘤的异质性

头颈部恶性肿瘤是全世界肿瘤死亡的重要原因。近年来，研究人员对头颈部恶性肿瘤内细胞异质性的认识有了很大的提高，但对这种异质性如何影响肿瘤发生发展的理解仍处于起步阶段[5]，认识这一过程对设计有效的头颈部恶性肿瘤治疗策略有着重大意义。Song等[6]第一次利用单细胞测序技术绘制出喉鳞状细胞癌的肿瘤内异质性的图谱进一步理解了喉癌的发生发展过程。头颈部恶性肿瘤细胞相关的的缺氧、应激、上皮分化和EMT表达程序在同一头颈部恶性肿瘤内部和不同头颈部恶性肿瘤间都存在异质性。Locasale等[7]三位研究人员在单细胞水平绘制头颈部恶性肿瘤微环境中的细胞代谢基因表达谱，揭示了头颈部恶性肿瘤的代谢异质性。Mroz等[8]认为等位基因肿瘤异质性评分可以作为头颈部肿瘤异质性的评价标准。相关研究表明在头颈部鳞状细胞癌患者中，肿瘤内的异质性与预后相关[9]。随着研究人员对头颈部恶性肿瘤异质性认识的加深，免疫检查点抑制剂的相关治疗方案的制定也不断的被质疑。Rasmussen等[10]用肿瘤比例评分和联合阳性评分研究PD-L1表达在头颈部恶性肿瘤中的肿瘤内异质性，结果发现用TPS评估PD-L1阳性率和CPS评估的PD-L1阳性率显著不同[10]，这证明PD-L1作为免疫检查点抑制剂治疗效果的预测标记物不可靠。综上所述，随着对肿瘤异质性研究的愈加深入，加深理解了头颈部恶性肿瘤的发生发展机制，推进了头颈部恶性肿瘤的个体化治疗方案的制定。

2.2 描述头颈部恶性肿瘤的微环境

口腔鳞状细胞癌的单细胞测序分析发现，非肿瘤细胞按照细胞类型分为8大类：T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌细胞，在头颈部恶性肿瘤中非肿瘤细胞尽管比例不同，但他们的表达状态和细胞类型一致。这些发现表明，针对间质细胞或免疫细胞的治疗(例如免疫检查点抑制)可能适用于所有肿瘤，而针对恶性肿瘤细胞的靶向治疗需要针对性策略。主要T细胞可分为四个亚群：调节性T细胞、常规CD4+T辅助细胞和两个细胞毒性CD8+T细胞群[11]。同其他亚群相比，细胞毒性亚群在共抑制受体(如PD1、CTLA4)表达上存在差异，CD8+T细胞群在不同的患者中也存在着显著差异。这些T细胞表达状态可能为预测对检查点免疫疗法的反应提供信息。

除了免疫细胞，间质细胞如肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)在肿瘤微环境中有着复杂的作用。肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤发生、肿瘤存活、细胞外基质重塑、免疫系统抑制和肿瘤侵袭有关[12]。研究人员用单细胞测序的方法区分出结直肠癌患者中的两个肿瘤相关成纤维细胞群体，称为CAF-A和CAF-B[13]。这个发现同头颈部恶性肿瘤中发现的肿瘤相关成纤维细胞群体相似，CAF-A细胞表达细胞外基质相关基因，CAF-B细胞表达肌成纤维细胞的标记物(例如ACTA2、PDGFA)。未来的单细胞研究将继续对肿瘤相关成纤维细胞群体进行亚型划分，确定其不同的表达状态，进一步研究头颈部恶性肿瘤中成纤维细胞的异质性对治疗抵抗的影响。

单细胞测序技术还可以在研究某类细胞命运决定中得以运用。如Fillbin等[14]发现了在H3K2M突变型胶质瘤中恶性特征最明显的少突胶质前体样细胞亚群中的关键分子PDGFRA和BIM1(命运决定点)。这种发现对认识肿瘤的发生发展十分重要。目前尚无单细胞测序在头颈恶性肿瘤细胞命运决定方面的研究，或许还可以根据这种突变基因研究出相关的靶向药物，将肿瘤局限于早期，这些都是研究人员在未来期望看到的成果。

2.3 评估头颈部恶性肿瘤的侵袭和转移

肿瘤的侵袭和转移是头颈部恶性肿瘤患者死亡的重要原因。在之前的研究中，研究人员认为上皮性肿瘤的上皮-间质转化是其淋巴结转移的驱动因子[15]。在对头颈部恶性肿瘤及其淋巴结进行单细胞测序时发现来自周围肿瘤相关成纤维细胞表达的TGF-β诱导肿瘤细胞的p-EMT状态，促进对周围组织的侵袭[16]。通过基于TCGA数据评估头颈部恶性肿瘤细胞的部分上皮-间质转化，发现部分上皮-间质转化与淋巴结转移、淋巴血管侵袭和囊外浸润有关，这表明恶性细胞和间质细胞一同向淋巴结扩散并形成淋巴结转移，而不是单个恶性细胞外渗和植入淋巴结床，这个发现提示可以利用免疫组织化学分析原发性肿瘤中的部分上皮-间质转化标记物，提高对隐匿性淋巴结或远处转移的预测。Puram等[11]对18例头颈部恶性肿瘤患者的单细胞转录组分析，进一步证实部分EMT可以作为淋巴结转移独立预测因子，这种预测可以减少N0分期的头颈部鳞癌中不必要的颈淋巴结清扫。同样，转录组测序分析发现神经侵袭(Perineural invasion，PNI)中的基因表达与上皮间质转化的功能状态相关[17-18]，尽管核磁共振成像和F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描能够评估头颈部恶性肿瘤的PNI，但早期PNI很少被检测到，这意味着上皮-间质转化相关程序可能作为早期PNI的预测因子。目前研究发现长非编码RNA是一种重要的生物标志物，许多研究证实长非编码RNA同头颈部恶性肿瘤的上皮-间质转化表达相关。Kolenda等[19]发现ZFAS1基因的表达影响头颈部恶性肿瘤的部分上皮-间质转化过程。相关研究还发现LINC00460通过PRDX1进入细胞核而促进头颈部恶性肿瘤细胞的部分上皮-间质转化过程[20]。这些长非编码RNA都可能成为头颈部恶性肿瘤预测预后的指标和治疗头颈部恶性肿瘤的潜在靶点。

2.4 探究循环肿瘤细胞的作用

循环肿瘤细胞已经成为临床上有效的检测肿瘤进展和预后的新工具。与原发性肿瘤相比，转移性和复发性癌细胞有新的体细胞变异，这增强了治疗过程中癌细胞的逃逸性。在临床中，通常很难对转移性或复发性肿瘤进行活检，而对循环肿瘤细胞进行单细胞测序可以在没有活检测序的情况下观察到肿瘤谱中体细胞的变化。循环肿瘤细胞可以检测肿瘤的异质性和推测肿瘤的进化形态[21]。对循环肿瘤细胞进行单细胞测序可以帮助研究人员更全面的了解肿瘤内异质性。而通过检测到的循环肿瘤细胞核苷酸突变而绘制出的肿瘤演化的早期突变图谱具有巨大的临床应用价值。目前循环肿瘤细胞在肿瘤中的研究结果仍富有争议，因为在大量研究中存在循环肿瘤细胞的检测技术的原理、方法不同和研究方法缺乏统一标准的问题，导致判断标准及检测结果存在较大差异，缺乏可比性[22]。在头颈部恶性肿瘤中对于循环肿瘤细胞的研究刚刚处于起步阶段，单细胞测序在这方面将有巨大的应用潜力。期望在未来看到更多相关研究成果的出现。

2.5 评价治疗效果和评估治疗抵抗

尽管采用积极的多模式治疗，仍有30%的头颈部恶性肿瘤患者会出现复发，60%的头颈部恶性肿瘤患者会出现局部转移[23]。对于难治性肿瘤，问题在于肿瘤细胞是否获得了能够生存的突变，或者是否始终存在一个通过选择性治疗压力存活下来的细胞亚群。Kim等[24]应用单细胞测序分析接受新辅助治疗的三阴性乳腺癌患者，发现在治疗耐药的患者中存在治疗耐药基因型，而且这种基因型是在新辅助治疗选择下发生的。在整个治疗过程中，基因组和转录组一直发生着变化，提示治疗抵抗的适应性和获得性机制同时发生，目前尚无头颈部恶性肿瘤在这方面的研究。利用单细胞测序技术进行头颈恶性肿瘤治疗抵抗相关方面的研究，将对头颈恶性肿瘤治疗产生深远影响。

3 小结与展望

单细胞测序对于头颈部恶性肿瘤的研究意义重大。肿瘤异质性的发现使研究人员不再将肿瘤的发生发展看作一个整体，而是不同成分之间的共表达的结果。对于微环境的研究揭示了病理和生理状态下不同的细胞亚群和某类细胞中的细胞亚群。上皮-间质转化作用的发现提供了潜在的预测指标和治疗靶点，为临床医生对头颈部恶性肿瘤患者做出早期有效的治疗提供支持。单细胞测序在评价头颈部恶性肿瘤治疗效果和治疗抵抗方面的应用可能对头颈部恶性肿瘤的治疗带来革命式的改变。单细胞测序更是促进了循环肿瘤细胞研究发展，使研究人员能在提取的细胞数目有限的情况下全面的进行遗传信息分析。单细胞测序技术近期蓬勃发展，但其在头颈部恶性肿瘤中的研究仍存在许多挑战。基因、病理和临床表现三者之间的确定关系仍有待于进一步研究。另外许多单细胞测序的数据具有患者特异性，这些数据是否适用于所有个体，这都是未来需要探究的问题。