华法林药物基因组学的应用

赵鑫龙，杨杰孚

（1.北京医院心血管内科/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院，北京 100730；2.北京协和医学院研究生院，北京 100005）

华法林从20 世纪40 年代被发现以来，凭借价格低廉，口服后经肠道快速吸收等优点，成为了包括静脉血栓栓塞性疾病的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等需长期抗凝治疗患者的常用药物。但使用华法林需长期检测国际标准化比值（international normalized ratio，INR）、药物起效及代谢失效时间长短不一等，目前有达比加群酯、利伐沙班、依度沙班等多种NOACs 新型口服抗凝药物（Novel oral anticoagulants，NOACs）的研发，为疾病的治疗提供更多的选择。虽然华法林剂量选择灵活，但针对不同人个体化差异较大，药物使用的不良事件也屡见不鲜。近年来越来越多的研究证实遗传因素对华法林稳态剂量的潜在影响，但是否利用遗传信息等变量指导华法林的使用仍存在不少质疑。诸多国内外学者致力于华法林基因组学的前瞻性研究，建立了多个给药模型，试图通过基因指导给药。本文就目前华法林基因组学的主要研究成果的基础上，对华法林个体化治疗的应用进展进行综述。

1 华法林药物作用机制和药代动力学

华法林是一类双香豆素衍生物，其可通过抑制维生素K 环氧化物还原酶（VKOR）发挥作用[1]。VKOR 主要由VKORC1 基因编码。通过影响氧化型维生素K 转变为还原型维生素K，从而影响凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和蛋白质C、S、Z 氨基末端谷氨酸残基的羧化反应，造成凝血因子无法激活活化，达到抗凝作用[2]。华法林经口服后进入胃肠道可被快速吸收，入血后主要与白蛋白结合，通常90 min 左右血药浓度达高峰。目前临床上使用的华法林是消旋酸光学异构体的混合物，包括了S 型和R 型华法林，其中S 型的效能是R 型的3～5 倍，S 型占据了华法林效应的60%～70%。两者通过不同的代谢途径在肝脏中代谢清除，S 型华法林具有约1.5 倍的全身清除率，比R 型华法林有效5 倍[3]。S 型华法林主要通过CYP2C9 代谢，可将S 型华法林催化成为无活性形式S-6-羟基或S-7-羟基华法林；而R 型华法林主要通过CYP1A2、CYP1A2、CYP3A4 和酮还原酶在肝脏中代谢为无活性的R-10-羟基华法林[4]。

2 华法林药物基因组学

2.1 细胞色素酶P450 2C9（CYP2C9）主要存在于肝脏、肠道细胞内质网上的细胞色素P450 家族（CYP）催化体内多种内、外源物质，其中CYP2C9 是编码细胞色素P450 家族酶2C9 蛋白（与华法林代谢酶活性有关）的基因，编码CYP2C9 蛋白的基因主要位于10 号染色体长臂（10q24.2），全长约为50 kb，包含9个外显子和8 个内含子，可读框长度为1472 bp。CYP2C9 基因具有多态性，其主要取决于编码区的SNPs[5]，目前已命名的SNPs 有62 种，分别以CYP2C9*1-CYP2C9*62 命名[6]。相关报道中出现最多的SNPs 为野生型CYP2C9*1、杂合突变型CYP2C9*2 和CYP2C9*3[7]。野生型的等位基因决定酶的活性，具备了正常酶代谢的高度活性，而突变型所编码的酶活性则相对有所降低。

CYP2C9 基因频率的分布存在明显差异。就种族而言，欧洲人群中最为常见，且研究最为广泛的突变是CYP2C9*2 和*3[8]。对于我国人群，Dai DP 等[9]根据我国汉族人群CYP2C9 分布建立的基因库显示，CYP2C9*1、*3的出现频率为94.48%、2.94%，而CYP2C9*2的出现频率并不高。由此可见，亚洲人群中CYP2C9*2 型突变较为罕见，90%以上的亚洲黄种人为野生型CYP2C9 *1。有研究表明[10]，CYP2C9基因多态性与抗凝治疗期间抗凝过度及出血并发症风险可能相关，因此明确基因型对合理抗凝起到重要作用。

2.2 VKORC1 基因 VKORC1 编码的蛋白质为组成维生素K 环氧化物还原酶复合体（VKORC）亚单位之一，其是维生素K 依赖性凝血因子生成的限速酶，同时也是华法林的作用靶点。VKORC1 基因位于位于16 号染色体短臂（16p11.2），全长约为100bp，包含3 个外显子。在VKORC1的编码区和非编码区存在较多的SNPs，其中对华法林使用剂量有影响的SNPs 主要位于：启动子区1639 位置G＞A，第一个内含子1173 位置C＞T[11]。VKORC1-1639GG和VKORC1-1173CC 称为野生型。与携带野生型个体所需的华法林剂量相比，携带杂合型1639AG 和1173CT的个体所需剂量较少。1639AA 和1173TT为纯合子的突变体，其携带者所需华法林剂量相比野生型更少[12]。在高加索人群中VKORC1-1173 等位基因TT、CT、CC 分布频率为16.3%、46.9%、36.8%，日本人群84.9%、15.1%、0，而在对我国汉族人群中其分布频率分别为81.4%、15.1%、2.5%[13]。高加索人群中VKORC1-1639 等位基因AA、GG、AG分布频率为14%、47%、39%，而在我国汉族人群中为80%、18%、2%。由此看来VKORC1 基因型在不同人种中分布不同。甚至一些研究显示[14]，亚洲不同地区VKORC1 基因型分布也存在差异，表现为1173-TT 和1639-AA 由东向西出现频率的递减。因此，上述研究可以很好的解释不同人种、不同地域的个体对于华法林剂量需求的不同。

2.3 CYP4F2 基因 CYP4F2 是编码细胞色素P450家族酶之一，基因位于19 号染色体短臂（19p13.11），作为一种维生素K1的单氧酶，可将维生素K1氧化为羟化的维生素K1，从而导致所需华法林剂量增多。目前部分研究发现CYP4F2*3（rs2108622）与华法林剂量显著相关，CYP4F2*3 主要位于11 号外显子，单核苷酸C 突变为T，造成蛋白水平的改变[15]。检索目前相关基因与华法林剂量相关的文献中发现[16，17]，黄色人种基因型为CC，CT和TT 所对应的基因型频率分别为52.68%，39.47%和7.85%；其他人种（黑色人种和白色人种）基因型为CC，CT 和TT 所对应的基因型频率分别为27.75%，36.30% 和35.94% 。有研究显示[18]，CYP4F2 基因的多态性可以影响我国汉族人群开始口服华法林抗凝治疗初始7 天的剂量，其研究中显示基因型TT的患者所需的华法林剂量（3.67±0.75）mg/d，而表现为CC 型的患者则需要（3.20±0.75）mg/d（P＜0.05）。CC 型患者使用华法林后INR首次进入治疗窗时间为（3.41±1.6）d，而基因型为TT的患者则需要（4.22±1.6）d（P＜0.05）。Li J 等[19]认为CYP4F2 基因多态性虽然对华法林的使用剂量有影响作用，但其作用低于CYP2C9、VKORC1 等遗传变量的影响。因此，对于CYP4F2 基因型是否对个体华法林剂量的影响仍需更进一步的研究和论证。

2.4 其他华法林药物代谢相关基因

2.4.1 载脂蛋白E（APOE）APOE 可参与富有维生素K的载脂蛋白向肝脏转运，主要由APOE 基因负责编码，存在三种突变类型。Yu WY 等[20]在2016 年对186例机械瓣置换术后口服华法林的患者进行基因测序时发现，APOE E2、E3、E4 等位基因频率分别为11.6%、82.5%、5.9%，人群中未检测到E2/E2 或E4/E4的基因型。之后经分析发现APOE E2/E3、E3/E3 和E3/E4 基因型携带者华法林的使用剂量存在显著差异（P＜0.05）。进一步对比发现E2/E3杂合子携带者的华法林每日维持剂量显著高于E3/E3 纯合子携带者（P＜0.05），而携带E3/E4 与E3/E3、E2/E3 与E3/E4的患者华法林剂量需求之间却无显著差异（P＞0.05）。

2.4.2 EPHX1 EPHX1 基因主要编码微粒体环氧化物水解酶（mEH），位于1q42.12 有9 个外显子和8个内含子。EPHX1 主要分布于肝脏内质网上，其基因多态性可使mEH的活性下降，从而通过影响维生素K 还原，来影响维生素K 依赖性凝血因子的活化过程[21]。国内外学者针对EPHX1 基因多态性也做出了不少研究，韩国学者[22]在2018 年对201例口服华法林的患者的16 个单核苷酸多态性进行检测，经多因素分析后发现EPHX1 rs1877724 基因位点对华法林稳定剂量有影响，剂量变异率占1.5%；国内学者研究发现[23]，EPHX1 rs2260863的非变异CC 纯合子与GC 杂合子相比，携带者华法林每日剂量需要显著降低。就目前的相关研究看来，部分研究成果可以解释小部分EPHX1 基因多态性与华法林剂量有相关性，但相较来说还是缺乏大规模的临床试验研究进一步证明。

2.4.3 GGCX γ-谷氨酰胺羧化酶主要由GGCX 基因所编码，其位于2 号染色的短臂，由15 个外显子组成。GGCX 直接参与翻译羧化，可使维生素K 依赖性的凝血因子以及蛋白C、S、Z 上的γ-谷氨酸残基发生羧化，使其成为有活性的凝血因子参与凝血过程[24]。GGCX 基因突变时，γ-谷氨酰胺羧化酶活性下降，GGCX 活性也同时下降，从而引起凝血因子活化异常，导致华法林使用剂量增加[25]。一项针对[26]我国新疆地区汉族房颤患者GGCX 基因rs11676382 位点多态性与华法林稳定剂量关系的研究中发现，基因型为CC、CG 和GG的患者华法林稳定剂量各不相同，CC 型所需剂量明显多余GG 型。另一项针对云南汉族人群GGCXrs699664 位点多态性的研究显示[27]，包括纯合子AA、GG 型、杂合子AG 型在内，3种不同基因型在心脏瓣膜置换术后所需华法林稳定剂量不同，分别是AA 型（3.507±1.44）mg/d；AG 型（3.46±1.236）mg/d；GG 型为（3.092±1.044）mg/d。目前国内外对于GGCX 基因多态性与华法林稳定剂量的研究结果较少，因此如需判断二者相关性，仍需许进行大规模的研究以进行证实。

2.4.4 NR1I2 孕烷X 受体（PXR）可由NR1I2 基因编码，其主要作用为调控CYP 酶，参与药物转运等[28，29]。在一项纳入201例接受华法林抗凝治疗患者的研究中发现[30]，PXR rs2472682（A＞C）与华法林稳定剂量显著相关，该变种纯合子携带者所需的华法林日剂量明显低于携带野生等位基因携带者。同时该研究通过建立多元回归预测模型，最终可以解释43.7%的华法林剂量个体差异。

2.4.5 细胞色素P450 氧化还原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）POR 是人肝微粒体细胞色素

P450 酶的唯一电子供体，其遗传多态性可能对一些药物代谢有部分影响[31]。有研究认为[32]，在CYP2C9*1患者中，POR rs17685 基因型中含T 等位基因携带者（CT、TT）华法林维持剂量（3.50±1.07）mg/d 要高于C等位基因携带者（CC）所需剂量（3.14±0.94）mg/d（P=0.03）。但由于缺少大规模的临床研究，因此POR及其多种SNPs 与华法林稳态剂量的关系仍有待进一步研究。

3 根据华法林基因多态性建立的药物剂量预测模型

华法林作为经典的口服抗凝药物，优点与缺点并存。个体间剂量差异大，传统的给药模式需要长期检测INR 进行剂量调整，导致使用华法林达到治疗窗时间及出血事件风险都变得难以掌控。因此国内外不少学者根据上述对华法林剂量有影响的因素，运用统计学方法推断出个体使用华法林稳定剂量预测模型。这些模型大部分都是基于年龄、体重、性别、种族以及华法林相关基因等因素所构建的多元性线性方程，其中有效应用药物基因组学信息指导华法林给药的预测模型，可以解释40%～60%的华法林剂量个体差异。众多的预测模型中绝大部分是将CYP2C9 和VKORC1 基因作为遗传预测因素。其中CYP2C9 主要测序分析*2 和*3的等位基因，而VKORC1 基因主要考虑-1639G＞A 或-1173C＞T 两种SNPs[33]。

国际华法林组织所指导的一项多中心研究的结果，建立了目前最为经典及使用广泛的IWPC 预测给药模型[34]。其纳入包括了来自9 个国家不同种族的4043例服用华法林并达到稳定治疗剂量（INR2-3）的患者，在进行验证队列中，该研究计算了华法林预测剂量在实际稳定治疗剂量20%范围内的患者百分比。研究发现与临床算法和固定剂量方法相比，遗传算法能够更准确地预测高剂量和低剂量组华法林患者的治疗剂量。因此，IWPC 研究证明了基因型指导给药算法的优势。目前国内外研究推算出的预测模型多是基于大量回顾性研究，与传统固定的用量给药相比，这些基于基因型多态性的预测模型可实现个体化给药，从而减少出血及栓塞事件，提高用药的安全性。

4 总结

尽管NOAC的应用不断增加，但华法林仍有着易于获取、价格低廉、适应症广泛等独特的优势，尤其是在全球医疗负担不断加重以及部分医疗资源有限地区患者仍无法接受及时抗凝治疗的背景下。与此同时，利用基因检测识别出不同程度华法林敏感度的个体，再考虑应用NOAC 或华法林抗凝治疗，能有效降低患者出血事件的风险。近年来针对我国汉族人群华法林基因多态性的研究取得了一系列重要的进展。因此，探索这些新的基因突变对华法林维持剂量的影响，对建立我国汉族人群特异的华法林药物遗传学算法，指导我国汉族患者精准化、个体化地华法林给药有着重要的意义。