通络益肾方对单侧输尿管结扎大鼠肾纤维化及肾上腺髓质素表达的影响

李冰 韩琳 韩佳丽 高誉珊 沈一凡 秦建国

摘要 目的：探讨通络益肾方对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化及肾上腺髓质素（ADM）表达的影响，并探究其可能的机制。方法：将50只雄性SD大鼠按随机数字表法分为5组：假手术组、模型组、通络益肾方组、缬沙坦组、ADM观察组，每组10只。分别采取相应的干预措施。Masson染色观察大鼠肾脏的病理改变;免疫组织化学法检测大鼠肾脏E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达;放射免疫法检测大鼠血清ADM水平;ELISA检测大鼠血清Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、肾组织ADM水平，并对肾组织ADM和E-cadherin进行相关性分析。结果：与假手术组比较，模型组血清ADM、PCⅢ水平明显升高（P<0.01），肾组织E-cadherin、ADM水平降低（P<0.01）。与模型组比较，通络益肾方组和缬沙坦组血清ADM、PCⅢ水平降低（P<0.01、P<0.05），肾组织E-cadherin、ADM水平升高（P<0.01、P<0.05）;ADM观察组血清PCⅢ水平降低（P<0.05），血清ADM、肾组织E-cadherin、ADM水平升高（P<0.05）。其中肾组织ADM与E-cadherin水平呈显著正相关（r=0.62，P<0.01）。结论：通络益肾方能够改善肾间质纤维化模型（UUO）大鼠肾间质纤维化，抑制纤维化指标PCⅢ的表达，上调E-cadherin的表达，其作用机制可能是通过上调肾脏局部ADM蛋白表达而实现的。

关键词 通络益肾方;肾间质纤维化;单侧输尿管梗阻;肾上腺髓质素;血清PCⅢ;E-钙黏蛋白

Abstract Objective：To investigate the effect of Tongluo Yishen Recipe（TLYSR） on renal interstitial fibrosis and ADM expression in UUO rats，and to explore its possible mechanism.Methods：A total of 50 male SD rats were randomly divided into 5 groups：a sham operation group，a model group，a TLYSR group，a valsartan group and a ADM treatment group，with 10 rats in each group.Corresponding intervention measures were taken in each group.The pathological changes of kidney were observed by Masson staining; the expression of E-cadherin in kidney was detected by IHC; the content of serum ADM was detected by radioimmunoassay; the content of serum PCⅢ and ADM in renal tissue were detected by ELISA，and the correlation between ADM and E-cadherin was analyzed.Results：Compared with sham operation group，the levels of serum ADM and PCⅢ in model group were significantly increased（P<0.01），and the levels of E-cadherin and ADM in renal tissue were decreased（P<0.01）.Compared with the model group，the contents of serum ADM and PCⅢ in TLYSR group and valsartan group were decreased（P<0.01，P<0.05），and the contents of E-cadherin and ADM in renal tissue were increased（P<0.01，P<0.05）; the contents of serum PCⅢ in ADM treatment group were decreased（P<0.05），and the contents of serum ADM，E-cadherin and ADM in renal tissue were increased（P<0.05），and the levels of ADM and E-cadherin in the renal tissue were positively correlated（r=0.62，P<0.01）.Conclusion：TLYSR can improve renal interstitial fibrosis in UUO rats，inhibit the expression of fibrosis index PCⅢ and up regulate the expression of E-cadherin，which may be achieved by up regulating the expression of ADM protein in kidney.

Keywords Tongluo Yishen Recipe; Interstitial fibrosis; UUO; ADM; PCⅢ; E-cadherin

中圖分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.010

肾间质纤维化（Renal Interstitial Fibrosis，RIF）是细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）过度沉积而造成的，是影响肾功能的重要因素，是各种慢性肾病进展为终末期肾病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要病因，改善肾间质纤维化对于延缓ESRD的进程意义重大[1]。研究表明，肾小管上皮细胞转分化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）是肾间质纤维化的主要机制之一，故进一步研究EMT的调控机制和减少ECM的合成是拮抗肾间质纤维化的重要途径[2-3]。肾上腺髓质素（Adrenomedullin，ADM）是一种血管活性多肽，可通过抑制转化生长因子-β1的表达，抑制肾小管上皮细胞的迁移等发挥拮抗肾间质纤维化的作用[4-5]。本课题组前期实验研究表明，活血化瘀中药能减轻肾间质纤维化病变，并明显上调ADM的表达[6-7]。为进一步证明其可能的作用机制，本研究以通络益肾方为干预药物，观察通络益肾方对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化及ADM表达的影响，探讨该方发挥抗纤维化可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取雄性SD大鼠50只，6周龄，体质量（200±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2012-0001]。饲养于SPF动物房内，饲养室温为25 ℃左右，湿度为50%左右，恒温恒湿，12 h/12 h明暗交替环境，自由饮水和进食。本研究经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（BUCM-4-2016111701-4023）。

1.1.2 药物 通络益肾方颗粒（丹参20 g、红花10 g、鸡血藤15 g等，北京康仁堂药业有限公司）;缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，批号：x1810）;肾上腺髓质素（AnaSpec公司，美国，货号：AS-60454）。

1.1.3 试剂与仪器 磷酸盐缓冲液（PBS）（福建迈新生物技术有限公司，货号：PBS-0060）;兔抗E-cadherin抗体（Proteintech公司，美国，批号：20874-1-AP）;Masson三色染色试剂盒（福建迈新生物技术有限公司，货号：MST-8003）;ADM放免试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号：20170922）;ADM ELISA试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号：20161207）;PCⅢ试剂（北京华英生物技术研究所，批号：HY-E0007）;封闭山羊血清工作液（北京康为世纪公司，货号：CW0130S）;兔超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：PV-9001）;抗原修复液（福建迈新生物技术有限公司，货号：DIG-3008）;DAB显色试剂盒（福建迈新生物技术有限公司，货号：DAB-0031）;4%多聚甲醛（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：P1110-500）;多聚赖氨酸（福建迈新生物技术有限公司，货号：GLU-0040）。生物组织包埋机（金华市益通医疗设备有限公司，型号：YD-6L）;酶标仪（无锡华卫德朗仪器有限公司，型号：DR-200BS）;光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：CKX41）;分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，型号：N5000）;-80 ℃冰箱（青岛海尔公司，型号：DW-86L578J）;高速冷冻离心机（Hitachi公司，日本，型号：CP100WX）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 选取50只SD大鼠适应性喂养1周后，分别置于代谢笼里取尿，检测其尿蛋白和尿红细胞指标均为阴性结果后开始实验。将大鼠按随机数字表法分为5组：假手术组、模型组、通络益肾方组、缬沙坦组、ADM观察组，每组10只。给予10%的水合氯醛，按30 mg/（kg体质量）的剂量腹腔注射麻醉，切开背部暴露出大鼠右侧肾脏，剥离出输尿管后于其中上1/3处结扎并剪斷，缝合腹部。假手术组仅剥离出输尿管后不结扎，随即缝合腹部。

1.2.2 给药方法 通络益肾方组给予通络益肾方1.5 g/（kg·d），灌胃给药;缬沙坦组给予缬沙坦10 mg/（kg·d），灌胃给药;ADM观察组于术中皮下埋放微量渗透泵，持续给予ADM（1～50）300 ng/h;假手术组、模型组、ADM观察组均每日予以等量的生理盐水灌胃。各组大鼠灌胃2周后称重杀检。由于术后感染，杀检时每组只剩下8只大鼠。

1.2.3 指标检测与方法

1.2.3.1 肾组织病理学检测 4 ℃条件下迅速剥离右侧肾脏，冠状位纵向剖开，放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋肾组织后切片，行Masson染色测定，光学显微镜下观察肾组织病理学改变。

1.2.3.2 各组大鼠血清ADM、血清Ⅲ型前胶原（PCⅢ）水平检测 收集各组血液样品后，分离血浆，按照说明书进行检测：腹主动脉取血2 mL，注入含有EDTA和抑肽酶抗凝的试管中，混匀，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，取上清液，置于EP管中，-80 ℃冰箱保存。采用放射免疫法测定血清ADM水平;酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清PCⅢ水平。

1.2.3.3 各组大鼠肾组织ADM水平检测 腹主动脉取血后，处死大鼠，取其新鲜右侧肾脏，剥离肾被膜，吸取血迹，轻轻研磨肾脏组织，于100 ℃的水浴锅中水浴10 min，再次进行研磨，然后4 ℃，3 000 r/min离心5 min，离心半径8 cm，取离心后的上清液，保存于-20 ℃的冰箱中。采用ELISA法检测肾组织ADM水平。

1.2.3.4 各组大鼠肾组织E-cadherin表达检测   采用免疫组织化学（SABC）法检测：一抗为小鼠抗大鼠E-cadherin（1∶800）单克隆抗体，摇匀，放置于湿盒中，用保鲜膜包裹，在4 ℃的冰箱中过夜;二抗为山羊抗小鼠IgG，摇匀，湿盒中放置25 min;DAB显色，光学显微镜下观察显色情况，显色呈棕黄色后终止染色。采用Image pro plus 6.0图像分析软件在200倍光镜下观察表达情况，每只大鼠选取5张切片，计算每张切片平均光密度值（累计光密度/视野面积），进行统计学分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组采用单因素方差分析，同时进行方差齐性检验，方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐性采用Tamhane-t检验;相关性采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织病理改变比较 肾组织Masson染色显示，假手术组肾脏基本无病变;模型组可见肾间质变宽，充满蓝紫色条索状胶原，部分肾小管萎缩;与模型组比较，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM组上述病变有不同程度的减轻。见图1。

2.2 各组大鼠血清ADM、PCⅢ水平表达比较 与假手术组比较，模型组血清ADM水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较，通络益肾方组和缬沙坦组明显降低（P<0.01），ADM观察组升高（P<0.05）。其中通络益肾方组和缬沙坦组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

与假手术组比较，模型组血清PCⅢ水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM观察组明显降低（P<0.01、P<0.05、P<0.05），其中3组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肾脏E-cadherin、ADM水平比较及相关性分析 在假手术组中E-cadherin表达主要见于肾小管细胞胞质和胞膜。与假手术组比较，模型组E-cadherin水平减少（P<0.01）;与模型组比较，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM观察组增加（P<0.01、P<0.01、P<0.05），3组间两两比较差异有统计学意义（P<0.01）。与假手术组比较，模型组肾组织ADM水平降低（P<0.01）;与模型组比较，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM观察组升高（P<0.05），其中3组间两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2，表3。

肾组织ADM水平与E-cadherin水平相关性分析数据显示，ADM与E-cadherin水平正相关（r=0.62，P<0.01）。见图3。

3 讨论

肾间质纤维化在中医上属于“水肿”“关格”“癃闭”“溺毒”等范畴。关于此病的病机认识，目前尚未有统一定论，多数医者认为该病是正气渐虚，邪毒渐盛，正邪相争，邪毒旺盛，正气衰竭的病理过程，以肾虚为本虚之根本，痰湿、湿热、瘀血、浊毒为标实[8-9]。秦建国教授结合多年临床经验，基于“久病必瘀”“久病入络”的中医理论，认为本病是因实致虚而成，病机关键为“肾络瘀损”[10-11]。病久瘀血阻于肾络，肾络瘀阻后引起该部分肾络结构的损伤和功能的废用，进而致使其他肾络过亢而损伤废用，最终肾体受伤，肾气化失司，水饮内停，溺毒留滞，百病丛生[12]。提出“通络益肾”的治则，治以通络益肾方。该方临床疗效显著，由丹参、红花、鸡血藤组成，结合本病病程较长，故方中选用了具有较强活血化瘀功效的丹参、红花，鸡血藤活血通络，可活肾之血络，通肾经之责，三药合用共奏活血化瘀通络之效。

肾小管上皮转分化是肾间质纤维化的中心环节，转分化后形成的肌成纤维细胞能增殖并分泌大量细胞外基质，肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质的过度聚集是肾间质纤维化的主要病理特征[13]。当发生肾小管上皮转分化时，E-cadherin减少或缺失，上皮细胞黏附性减少，基质胶原成分积聚，肾小管基底膜崩解等，其中E-cadherin表达的减少和缺失是最显著的特征，也是肾小管上皮转分化的第一步[14-15]。Ⅲ型膠原是细胞外基质的主要成分之一，血清PCⅢ是Ⅲ型胶原的前体。研究表明，血清PCⅢ是肾间质纤维化的独立影响因素，故将E-cadherin、PCⅢ作为研究肾间质纤维化的重要观察指标[16]。本研究Masson染色结果显示，各手术组可见不同程度的纤维组织增生，发生纤维化改变，各观察组较模型组胶原纤维沉积减少，纤维化程度减轻，说明通络益肾方能够抑制纤维组织增生;模型组肾组织E-cadherin表达较假手术组明显降低，血清PCⅢ表达较假手术组明显升高，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM组肾组织E-cadherin表达较模型组有不同程度升高，血清PCⅢ表达较模型组有不同程度降低，说明通络益肾方能抑制肾间质细胞的表型转化，减少细胞外基质沉积，进而抑制肾间质纤维化的进程。

ADM作为一种血管活性多肽，在肾脏中的表达和分布较多，以自分泌或旁分泌的方式，发挥扩张血管、降低血压，拮抗TGF-β1表达，抑制细胞增殖，抑制肾小管上皮、内皮、血管平滑肌细胞迁移等生物学作用。目前研究表明，各种肾脏疾病的发病机制与ADM密切相关，在疾病的进程中存在着不同程度表达的变化，提示ADM在肾脏疾病的治疗中可能有重要的前景[17]。

Dong等[18]研究表明，ADM可通过调节HIF-1对远程缺血预处理引起的大鼠肾脏损伤起到保护作用。郝娟等[19]研究发现，ADM能抑制ALD诱导的HK-2细胞自噬，从而减少肾小管损伤，延缓肾损伤过程。本实验中，大鼠肾组织ADM检测结果显示，模型组肾组织ADM水平较假手术组降低，通络益肾方组、缬沙坦组、ADM组较模型组升高，说明药物的治疗可以上调肾组织ADM水平。与此同时，本实验亦观察了血清ADM水平变化，发现模型组血清ADM较假手术组升高，通络益肾方和缬沙坦组较模型组降低，ADM组较模型组升高。说明单侧输尿管结扎造成大鼠肾脏损伤时，血清ADM代偿性增加，这一点与以往的研究结果一致[20-22]。给予外源性ADM治疗后，血清ADM、肾组织ADM均增加，据此我们推测ADM对单侧输尿管结扎大鼠肾脏的保护作用与血清ADM无关，与肾脏局部ADM密切相关，提示ADM可能以旁分泌的方式参与该病的进程。分析肾组织ADM与E-cadherin的相关性，结果显示，肾组织ADM与E-cadherin呈显著正相关性，表明通络益肾方能够改善肾间质纤维化模型（UUO）大鼠的肾间质纤维化，抑制纤维化指标PCⅢ的表达，上调E-cadherin的表达，其作用机制可能是通过上调肾脏局部ADM蛋白表达而实现的，但其具体机制尚待进一步研究。

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（2020-11-20收稿 责任编辑：杨觉雄）