AZF区微缺失检测方法分析Y-STR基因座分型缺失现象*

赖 力，吴贻晨，陈 点，王尧城，刘尚龙

1.福建省立医院司法鉴定所/福建省心血管病重点实验室，福建福州 350001；2.福建医科大学省立临床医学院，福建福州 350001；3.福建中医药大学第一临床医学院，福建福州 350001

Y染色体短串联重复序列(Y-STR)作为一种特殊的遗传标记，在法医学个体识别和亲缘鉴定方面具有不可或缺的作用，尤其是在父源关系鉴定方面，Y-STR基因座分型是判断不同男性个体是否来自同一父系的主要依据。作为人类唯一的单倍体遗传染色体，Y染色体易发生染色体内非等位性重组，因此Y-STR基因座比常染色体短串联重复序列(STR)基因座具有较高的变异率。实践中发现，部分Y-STR基因座存在分型缺失(又称为无效扩增)现象，与Y染色体长臂或短臂上部分基因片段的缺失有密切关系，因此男性不育症患者的Y染色体无精症因子区域(AZF区)微缺失也可能是导致部分Y-STR基因座分型缺失的原因。

本研究对实验室日常DNA-STR基因座检测过程中发现的Y-STR基因座分型缺失的样本进行Y染色体AZF区微缺失检测，旨在探讨由Y染色体AZF区微缺失造成的Y-STR基因座分型缺失对个体识别和父源关系鉴定的影响以及Y-STR基因座作为男性不育症基因检测方法的可行性，并且选择合适的Y-STR基因座进行个体识别和父源关系鉴定。

1 资料与方法

1.1样本来源 收集本实验室日常进行个体识别以及亲缘鉴定DNA-STR基因座检测的个体，每人份采集EDTA抗凝血2 mL，-20 ℃保存。

1.2仪器与试剂 Y-STR基因座分型采用AGCU Y24、GFS 24Y检测系统(无锡中德美联公司)以及Promega Y23检测系统(美国Promega公司)，主要仪器为Veriti扩增仪(美国AB公司)和3130型遗传分析仪(美国AB公司)。Y染色体AZF区序列标签(STS)位点检测使用Y染色体微缺失检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法，北京阅微基因技术公司)，主要仪器为Gen Reader基因分析仪(北京阅微基因技术公司)。

1.3方法 采用Chelex法提取DNA。Y-STR基因座复合扩增的体系配置和扩增循环参数参照各自试剂盒说明书，扩增产物的电泳分离和荧光检测在3130型遗传分析仪上进行，采用Data Collection 3.0软件收集DNA片段的荧光信号，GeneMapper ID v3.2分析软件进行数据分析，获得43个Y-STR基因座分型结果。对存在Y-STR基因座分型缺失的个体进行AZF区STS位点检测，检测位点为SRY、ZFY、sY86、sY84、CDY2、SMCY、sY127、sY134、sY1161、sY1191、sY254、sY255、DAZ、sY157、CDY1、ZFX、SMCX、DAZL，反应体系20 μL，包含2.5×PCR Mix 8 μL；5×Y-Primer Mix 4 μL；模板DNA 1 μL(8.6 ng/μL)；无核酸酶纯水7 μL。PCR扩增程序：(1)变性95 ℃，5 min；(2)扩增94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，1 min 30 s；30个循环；(3)延伸60 ℃，60 min；(4)4 ℃或15 ℃低温保存。PCR扩增产物经毛细管电泳检测，根据产物峰面积比例以及缺失情况确定Y染色体微缺失位点。

2 结 果

本研究共发现3例样本存在Y-STR基因座分型缺失现象，其中1例样本(编号1)采用GFS 24Y检测系统发现DYS459和DYS527ab基因座分型缺失，用AGCU Y24检测系统发现DYS527ab基因座同样存在分型缺失(图1)。进一步进行Y染色体微缺失检测，结果显示该样本丢失sY255、sY1191、CDY1、sY254和DAZ等STS位点，经分析发现该样本为AZFc区缺失(b2/b4)，见图2。

注：A为GFS 24Y检测系统;B为AGCU Y24检测系统;画圈处为分型缺失的基因座;横轴处方框内数字表示基因座基因型,如DYS446基因座基因型为13，DYS443基因座基因型为13。

本研究还发现2例存在父子亲缘关系样本(编号2、3)的Y-STR基因座分型结果一致，均存在DYS522、DYS570和DYS576 3个基因座分型缺失，其余基因座分型为单倍型(图3)。对两份样本进行Y染色体微缺失分析，结果显示两份样本检测结果一致，AZF区均未发现缺失，SRY基因均正常。

注：A为AGCU Y24检测系统;B为Promega Y23 检测系统;画圈处为分型缺失的基因座;横轴处方框表示基因座基因型,如Y GATA H4基因座基因型为12，DYS447基因座基因型为24。

3 讨 论

Y染色体作为男性独有的性染色体，具有单倍体父系遗传的特点。除突变和缺失外，同一家族中所有男性个体的Y-STR基因座分型结果理论上应完全一致，这也是个体识别以及父源关系鉴定中判断男性个体是否来自同一父系的主要手段。Y染色体的非重组区含有大量高度同源的重复序列，导致该区域结构高度不稳定，较容易发生染色体内非等位的同源性重组，从而导致Y染色体出现缺失、倒置和重复等结构异常现象。多项研究报道了Y染色体上的遗传标记Y-STR基因座分型缺失现象[1-5]。Y-STR基因座数据库的建立，选择的检测位点数增多，更有助于发现分型异常及缺失[6]。

临床研究表明，位于Y染色体的AZF区的缺失可能会导致无精症或严重少精症等男性不育症的发生。Y染色体AZF区被划分为AZFa、AZFb、AZFc 3个互相间隔的亚区，不同区域的AZF区缺失可对应导致无精症或严重少精症等男性不育症的发生[7-9]。AZFa区缺失的患者主要临床表现为唯支持细胞综合征(SCOS)；AZFb区缺失的患者主要临床表现为精子成熟过程停滞在精母细胞，出现成熟障碍；AZFc区缺失表现为不同程度的精子数量减少。叶峻杰等[10]研究报道，在中国汉族男性不育人群中，AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc区缺失的比例分别为5%、5%、15%和75%。本研究发现1号样本也存在AZFc区缺失，由于样本来源为未成年人，故无法对其生育能力进行鉴定。

AZF基因位于Y染色体Yq11区域，目前用于个体识别和父源关系鉴定的部分Y-STR基因座也位于该区域。现有研究表明，AZFa区缺失的患者存在DYS437、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS439等位点的缺失，AZFb区缺失的患者存在DYS392、DYS385a/b、DYS549等位点的缺失，AZFc区缺失的患者存在DYS448、DYS527、DYS459等位点的缺失[11-12]。本研究发现3例Y-STR基因座分型缺失的个体，其中1号样本发现DYS459和DYS527ab位点缺失，经AZF区STS位点检测发现存在AZFc区的缺失，与王跃力等[12]的研究结果一致，表明上述Y-STR基因座可能位于Y染色体AZF区，故当AZF区STS位点存在微缺失时，与STS位点相关的Y-STR基因座也可能发生分型缺失。2号和3号这2例具有亲缘关系的个体均发现DYS522、DYS570和DYS576 3个Y-STR基因座分型缺失，但AZF区STS位点检测未发现缺失和异常，表明上述Y-STR基因座的分型缺失不是由AZF区STS位点微缺失所造成，可能是由Y染色体上其他区域的染色体片段缺失或者基因座引物结合区的碱基序列发生变异所导致。

铁展畅等[13]研究报道，DYS449、DYS458、DYS481、DYS522、DYS570、DYS596、DYS627、DYS576等基因座缺失与位于Yp11.2区域的Amel-Y片段缺失具有一定相关性。本研究结果提示，Y染色体AZF区各类型STS位点的微缺失会引起DYS522、DYS570、DYS576、DYS549、DYS527ab等部分Y-STR基因座的分型缺失，说明该部分Y-STR基因座位于Y染色体AZF区内，与男性无精症或严重少精症等不育症具有一定联系。因此，在日常鉴定工作中发现上述Y-STR基因座分型存在部分或全部缺失的个体可以高度怀疑其AZF区存在微缺失，可增加Y染色体AZF区STS位点的检测，以发挥Y-STR基因座作为分子遗传标记物在遗传疾病检测方面的作用。目前该方面的研究较少，有待后续进一步扩大样本量进行验证。鉴于部分Y-STR基因座分型会受到AZF区微缺失等染色体疾病的影响，故在进行个体识别和父源关系鉴定时，应尽可能避免使用易发生缺失的Y-STR基因座进行分型检测，实验室应配备多套检测试剂以备复核。