川蛭通络胶囊对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

杨海燕 李彦 孔咏梅

脑卒中主要由脑血管出血或阻塞导致，其中因血管栓塞导致的缺血性脑卒中尤为常见，约占80%[1]。世界范围内，脑卒中已成为人类仅次于心脑血管和癌症的第三大死因，也是成人致残的主要原因[2,3]。临床缺血性脑损伤治疗的原则之一是尽早恢复血液再灌注，溶栓治疗是惟一推荐用于治疗脑缺血的治疗方法，然而，其受到治疗窗窄和高出血风险并发症的限制[4]。研究表明，缺血性脑损伤的机制不仅仅局限于脑组织本身的缺血缺氧性损害，而且还在于缺血后产生的一系列的级联式反应，比如炎性反应、氧化应激反应、凋亡反应及细胞修复能力减弱等[5,6]。同时，脑缺血后再灌注也会造成脑损伤，导致脑水肿、脑出血和神经元死亡，这种现象被称为脑缺血/再灌注损伤。川蛭通络胶囊(CZTLC)经国家食品药品监督管理局批准，用于中风病中经络(脑梗死)恢复期血瘀气虚证，症见：半身不遂，言语涩或不语，偏身麻木，口舌歪斜，神倦乏力，舌质暗，或有瘀斑、瘀点，舌下青筋显露，脉沉细、细涩或细弦，苔薄白。复方中药CZTLC由水蛭、川芎、丹参、黄芪4味药组成，以补阳还五汤为依据研发而成[7]。活血化瘀为中医治疗的根本方法，气血同治、以气行血的观点使得CZTLC在脑梗死恢复期的治疗中有效[8,9]。Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果证实，该药在中风病综合疗效、神经功能缺损评分及中医症候疗效等方便效果显著。然而，目前对川蛭通络胶囊的生物学效应背后的具体机制还没有完全了解。因此本研究采用小鼠建立大脑中动脉缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)进行缺血性脑损伤研究，进而探索CZTLC 对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10 周龄健康雄性ICR小鼠，SPF级，体重20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)2018 0008]。小鼠饲养于鲁南制药集团股份有限公司新药安评中心，饲养环境：12 h 光照/黑暗交替，温度(25±1)℃，湿度(65±5)%。

1.2 药品与试剂 川蛭通络胶囊(鲁南厚普制药有限公司，国药准字Z20090031)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)、TTC 染色试剂盒试剂盒购于南京建成生物工程研究所；小鼠白介素-4(IL-4)、IL-10、TNF-α及IL-1β ELISA试剂盒购自R&D Systems；Bax、Bcl-2及Caspase-3一抗购于abcam。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药:随机将小鼠分为假手术(sham)组、脑缺血再灌注损伤(MCAO/R)组、川蛭通络胶囊治疗(CZTLC)组，每组15只，其中CZTLC的剂量依据临床用药剂量换算小鼠给药剂量为0.06 g/kg，建模之前连续 5 d口服灌胃给药，3次/d。

1.3.2 MCAO/R模型建立:参照 Memezawa等[10]的方法，采用0.7%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，将小鼠仰卧位，常规颈部皮肤消毒、去毛及切皮，暴露左侧颈总、颈内及颈外动脉，距颈总动脉分叉处约0.5 cm于颈外动脉剪一小缺口，线拴由颈外动脉进入颈内动脉至大脑中动脉，深度距离颈总动脉分叉处约 1 cm 时感有阻力时停止进线，结扎颈外动脉缺口及缝合皮肤并至于 37℃ 恒温室内，缺血 1 h 后抽出线拴进行脑组织再灌注。操作全部完成后，将小鼠放置37℃ 恒温室内单笼饲养。其中对照组仅将颈外动脉剪一小切口并结扎。

1.4 神经行为学评分 小鼠再灌注 24 h 后，对其进行神经行为学评分，依据Wang等[11]将神经功能缺损程度分为 5 个等级：0 分：正常，无神经功能丧失；1分：对侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，小鼠向对侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时身体向对侧(瘫痪侧)倾倒，中度神经功能缺损；4分：不能行走，意识水平低下或动物死亡。

1.5 小鼠脑梗死面积的分析 神经功能评估后，处死小鼠，取脑组织进行TTC染色[12,13]。将脑切成2～3 mm厚的连续冠状切片，放置配好的TTC染液中，37℃染色15 min，取出，用水冲洗，并拍照记录。正常脑组织染色为红色，梗死组织未染色(白色)。用 ImageJ 软件处理图像，以乘积法计算 IS 范围，并以每个脑片重量进行校正[14]。脑梗死面积比以 IS 占留取脑组织质量百分比表示。

1.6 HE、甲苯胺蓝染色 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，处死取出脑组织，快速放到10%中性缓冲甲醛溶液(湖南尔康制药股份有限公司，H43020198)，固定48 h。随后在梯度乙醇中脱水，石蜡包埋，手轮式切片机将脑组织切成3～5 μm，用于HE、甲苯胺蓝染色，显微镜下对各组脑组织的病理形态、神经元损伤程度进行评价。

1.7 炎性因子、SOD及MDA含量检测 分别以化学比色法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；ELISA 法测定脑组织中L-4、IL-10、TNF-α及IL-1β表达水平，均按试剂盒说明书进行操作。

1.8 RT-PCR及Western Blot检测Bax、Bcl-2及Caspase-3基因及蛋白表达水平 TRIzol试剂提取脑组织中总RNA，各组取等量RNA通过cDNA试剂盒试剂盒进行反转录，通过PCR扩增Caspase-3、Bax、Bcl-2及GAPDH的cDNA。扩增的cDNA用1%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，电泳凝胶成像分析系统观察。利用Image J analyzer软件对各条带的凝胶图谱进行定量。在蛋白提取前，先对标本进行称重，每100 mg组织中加入1 ml RIPA、1 0 μl PMSF，组织匀浆，低温离心机(12 000 r/min)离心15 min。提取的蛋白上清液与上样缓冲液按照4∶1体积混合后在沸水中煮5 min，至蛋白变性。蛋白上样，电泳至溴酚蓝条带到凝胶的下方，至指示蛋白分子量的Marker条带全部显出。电泳结束后，把凝胶移到PVDF膜上。上述操作完成后，把PVDF膜转移到含5%脱脂奶粉封闭液的平皿内，孵育2 h，随后加一抗4℃孵育过夜。然后用TBST振荡洗涤3次×8 min，室温下与二抗共同孵育1 h，再使用TBST振荡洗涤3次×8 min，其后在PVDF膜上滴加显色剂，进行显色照相。最后用quantity one软件对条带进行分析。

2 结果

2.1 川蛭通络胶囊对小鼠MCAO/R脑损伤后的神经行为学表现及梗死面积的影响 手术当天定义为第0天，-120 h开始口服灌胃给药，连续给药5 d，给药3次/d，手术后24 h对小鼠进行行为学评分，后对动物安乐死取脑组织，进行后检测。MCAO/R组、CZTL组神经行为学评分、小鼠脑梗死面积高于Sham组，CZTL组神经行为学评分、脑梗死面积低于MCAO/R组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1、2。

图1 实验流程

图2 3组脑梗死面积

表1 3组小鼠脑缺血再灌注24 h后的神经行为学评分比较 n=15,分,

表2 3组小鼠脑梗死面积比较

2.2 3组小鼠脑组织皮层和海马CA1区组织病理学观察 HE染色、尼氏染色显示，与Sham组比较，MCAO/R可明显诱导左侧皮层和海马CA1区神经元损伤(P>0.05)。MCAO/R组大鼠脑组织损伤侧主要表现神经元细胞体积缩小，胞浆空泡变性，细胞间排列疏松，海马、皮质的神经元大部分萎缩；细胞内尼氏小体数量减少，染色变浅。与MCAO/R组比较，观察到CZTLC组小鼠脑组织区域神经元细胞损伤较轻微，表现为神经细胞的紧密排列和细胞内尼氏小体数量增加。同时，我们发现与Sham组相比，药物处理组海马CA1和皮层的正常神经元数量显著减少。综上，川蛭通络胶囊显著减轻了皮层及海马CA1神经元的损伤。见图3。

图3 川蛭通络胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠皮层及海马CA1区病理组织学改变的影响(HE、甲苯胺蓝 × 400)

2.3 川蛭通络胶囊对小鼠脑组织SOD活性及MDA含量的影响 Sham组小鼠脑组织SOD活性明显高于MCAO/R组，MDA水平明显低于MCAO/R组(P<0.05)；与MCAO/R组相比，CZTLC组小鼠脑组织中SOD活性显著升高，MDA水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 3组小鼠脑组织SOD活性及MDA水平

2.4 川蛭通络胶囊对脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表达的影响 MCAO/R组小鼠脑匀浆 TNF-α、IL-1β及IL-6含量较Sham组明显升高，而 IL-10 含量明显降低(P<0.05)。CZTLC组小鼠脑匀浆TNF-α、IL-1β 及IL-6含量较MCAO/R组明显降低，而 IL-10 含量明显升高(P<0.05)。见表4。

表4 3组小鼠血清炎性因子水平比较

2.5 川蛭通络胶囊可明显抑制小鼠脑组织细胞凋亡相关基因及蛋白的表达 CZTLC可显著下调凋亡蛋白 caspase-3 及 Bax 在基因水平及蛋白水平的表达，同时其亦明显上调Bcl-2的表达，与CAMO/R组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图4。

图4 小鼠脑组织中Bax,Bcl-2,Caspase-3 mRNA和蛋白质表达情况

表5 3组小鼠caspase-3、Bax及Bcl-2基因表达情况

3 讨论

本研究中，我们提前给予小鼠CZTLC进行干预，后手术栓塞颈部中动脉1 h，再灌注24 h 造成小鼠脑组织损伤，探讨CZTLC是否具有神经保护作用及可能的作用机制。CZTLC是中国食品药品监督管理局批准的著名中药，临床使用已有10多年。从实验研究中了解CZTLC的生物学机制，有助于开发CZTLC治疗脑缺血的潜在临床应用。本研究表明，CZTLC可以保护小鼠大脑免受脑缺血-再灌注损伤，包括减少神经功能缺损和脑梗死面积、抑制炎性反应及抗氧化应激。通过HE、甲苯胺蓝染色，我们发现CZTLC抑制脑细胞坏死，改善大脑皮层及海马神经元形态，亦从基因和蛋白水平证实CZTLC可以抑制脑细胞凋亡。

脑缺血和再灌注均可导致神经元损伤[15]。神经行为学评分、脑梗死体积是评价模型成功和药物有效性的直接简便的观察方法。本研究结果显示，CZTLC可明显改善MCAO/R神经行为学和脑组织的坏死。

研究发现，炎症参与脑缺血再灌注损伤发生发展过程，其中TNF-α和IL-1β是炎症的两个重要因子，参与血脑屏障的通透性和促进部分炎性介质表达[16,17]。IL-10是一种抗炎因子，通过抑制白细胞和小胶质细胞分泌IL-1、TNF-α等细胞因子，对神经细胞发挥保护作用[18]。本实验研究结果表明，CZTLC处理组IL-10的表达量显著升高，而IL-1β、TNF-α及IL-6水平模型组明显高于药物处理组。

在正常生理条件下，体内生成的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的催化作用下还原为过氧化氢，在谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶的作用下进一步还原为无害的水和氧气，从而维持体内ROS的动态平衡[19]。在脑缺血再灌注时产生大量氧自由基，同时SOD活性降低，清除氧自由基的能力减弱[20]，而脂质过氧化物MDA含量明显升高[21]，组织发生脂质过氧化，导致氧化与抗氧化平衡失调、ROS增加，从而导致脑组织氧化应激反应，造成脑组织损伤。本实验中模型小鼠脑内存在氧化应激损伤，CZTLC提前干预组小鼠脑组织SOD活性显著增加，MDA含量显著降低，提示CZTLC能明显降低模型组小鼠脑内氧化应激损伤。

脑组织持续存在缺血缺氧损伤会诱发细胞凋亡，这是脑梗死程度进一步加重的主要机制之一[22]。神经元缺血缺氧后可激活Bax及caspase-3蛋白，从而启动细胞凋亡[23-25]。本研究结果显示，CZTLC预处理组，小鼠脑组织Bax,Baxcaspase-3蛋白表达显著降低，Bcl-2水平明显升高。

综上所述，CZTLC能够通过改善脑缺血再灌注损伤的神经行为学及减轻脑梗死面积，并能进一步通过抗氧化应激、抑制炎性反应及抗细胞凋亡，达到减轻缺血性损伤的作用，但其具体机制及疗效还需要进一步的实验研究。