麻城黑山羊MC4R基因遗传多态性及生物信息学分析

郭帅，杨娟，刘诗雨，杨丰利，熊琪，汪招雄

（1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省农科院畜牧兽医研究所，武汉 430064）

MC4R（melanocortin receptor-4）是G蛋白偶联受体超家族的一员，一种肽类物质，分泌部位在哺乳动物的下丘脑内侧核。不仅存在于下丘脑，还广泛存在于大脑皮质、丘脑、脑干和脊索等中枢神经系统中［1］。MC4R在大脑的食欲调节区域参与瘦素信号传递，是调节能量动态平衡的重要信号分子。MC4R能与内源性配体黑色素细胞刺激素（alpha melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）、刺鼠蛋白（agouti-signaling peptide，ASIP）及其相关蛋白（Agoutirelated proteins，AGRPs）结合［2］。α-MSH是阿片-促黑素细胞皮质素原（Proopiomelanocortin，POMC）的分解产物，为MC4R的内源性激动剂。ASIP及AGRPs等由外周神经元细胞合成，是MC4R的内源性拮抗剂［3］。MC4R通过与激动剂、拮抗剂的互作来控制食欲和维持体态。敲除MC4R基因小鼠表现出采食量增加、脂肪沉积变快以及胰岛素过量分泌等特征［4］。

研究表明，MC4R基因是猪、牛、鸡等畜禽重要经济性状的候选基因［5］。猪MC4R基因与脂肪性状的关联分析发现，与猪胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌宽度、眼肌面积、皮率呈显著相关［6］。牛MC4R基因与胴体性状的关联分析发现，与秦川牛背膘厚显著相关［7］。鸡MC4R不同基因型也与体重、全净膛重、腿肉重等存在显著或极显著相关［8］。

麻城黑山羊是湖北省优良地方山羊品种，具有毛色纯黑，耐粗饲，繁殖能力强，遗传性能稳定等特点［9］。目前，关于麻城黑山羊MC4R基因遗传多样性及其功能的研究还未见报道。本研究通过基因测序，寻找麻城黑山羊MC4R的多态位点，并利用生物信息学方法，分析预测其结构和功能，为进一步研究MC4R基因及其自然突变体调节细胞信号转导及影响麻城黑山羊生长代谢的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集及血液DNA提取

30只麻城黑山羊样本采自湖北金旸（麻城）畜牧有限公司。山羊颈静脉采血5 mL至肝素钠抗凝管。采用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取血液基因组DNA。

1.2 引物设计及PCR扩增

根据NCBI中山羊MC4R基因序列（GenBank登陆号为NM_001285591.1），采用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1），交由武汉奥科生物公司合成。PCR扩增反应体系为25 μL，其中混合DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，灭菌双蒸水9.5 μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，35个循环，最后72℃终延伸5 min，4℃保存。PCR产物送武汉奥科生物公司测序。

表1 麻城黑山羊MC4R基因扩增引物序列信息

1.3 多态性位点分析

利用DNAStar软件的SeqManⅡ程序，将测序结果与MC4R基因参考序列进行分析比对，扫描SNPs位点。

1.4 等位基因频率估算

将SNPs位点峰图上传至MWSnap应用软件进行峰值测量，带入公式对等位基因频率进行估算［10］。

式中，∱i表示SNP位点等位基因的频率；hi表示测序图上等位基因1或2峰值。

1.5 生物信息学分析

1.5.1 理化性质分析及疏水性结构预测 使用Ex-PAsY Protparam软件对MC4R蛋白的相对分子质量（MW）和等电点（PI）等进行预测；使用在线软件ProtScale对MC4R蛋白的疏水性结构进行预测。

1.5.2 MC4R的亚细胞定位、信号肽及跨膜结构预测 使用SignalIP 5.0版本软件对信号肽进行预测分析，使用SubLoc V1.0软件对MC4R亚细胞定位情况进行分析；使用TMHMM Server软件对MC4R蛋白跨膜结构进行预测。

1.5.3 预测蛋白的糖基化位点和磷酸化位点 使用NetNGlyc在线软件来预测麻城黑山羊MC4R蛋白的N-糖基化位点；使用NetOGlyc-4.0版本在线软件预测麻城黑山羊MC4R蛋白的O-糖基化位点；使用Net Phos 3.1版本在线软件来预测黑山羊MC4R蛋白的磷酸化位点。

1.5.4 二级结构预测 使用Predictprotein在线工具预测MC4R蛋白二级结构。

1.5.5 系统进化树 下载绵羊、牛、猪、鸡、犬等物种的MC4R氨基酸序列，与麻城黑山羊MC4R氨基酸序列一起上传到NCBI中的Blast在线软件进行多重序列比对，用MEGA构建系统发育树，分析MC4R蛋白序列在不同物种间的进化情况。

1.5.6 结构域及功能位点预测 使用STRING在线软件对MC4R蛋白结构域的功能位点进行预测。

2 结果与分析

2.1 麻城黑山羊MC4R基因的克隆

以混合DNA样本为模板扩增MC4R基因CDS区序列，通过凝胶电泳来检测扩增产物（图1）。由图1可知，PCR扩增条带明亮，扩增出约1 000 bp的片段，与预测结果相符。

图1 PCR扩增产物电泳结果

2.2 麻城黑山羊MC4R基因多态位点扫描

麻城黑山羊混池测序结果表明，在MC4R基因中共检测到8个突变位点（图2）。

图2 麻城黑山羊MC4R突变位点

2.3 麻城黑山羊MC4R的等位基因频率估算及突变类型分析

使用李平等［10］等位基因频率估算的方法，用MWSnap软件测量所有突变位点等位基因的峰高，并根据公式计算等位基因频率。突变类型分析发现，麻城黑山羊MC4R基因第649号位点和第784号位点为同义突变，没有导致氨基酸变化；其余突变位点为错义突变，氨基酸变化详见表2。

表2 麻城黑山羊MC4R基因的SNPs等位基因频率

2.4 麻城黑山羊MC4R蛋白的理化性质分析和疏水性结构预测

MC4R蛋白的分子式为C1664H2619N413O454S24，蛋白质相对分子质量为36 443.55 g/mol，理论等电点（PI）为7.52。MC4R氨基酸序列中亮氨酸（Leu）含量最多，占氨基酸总量的11.4%，色氨酸（Trp）含量最少，占氨基酸总量的0.9%，没有吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。正、负电荷残基数分别为16、17。不稳定系数为47.86（＞45为不稳定），提示MC4R为不稳定蛋白。蛋白亲水性为0.778，说明MC4R为疏水蛋白。用ProtScale进一步对麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性结构进行预测分析（图3），其亲水性/疏水性最小值为-1.967，最大值为3.367，总体表现为疏水性，与前面的亲水性分析相互验证。

图3 麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性结构

MC4R的8个突 变位点 中有2个即C617A和C649G，使蛋白质理化性质发生变化。突变后的相对分子质量变为36 488.04，理论PI值变为7.09，正电荷残基数目变为17，仍然为不稳定疏水性蛋白。其余6个突变体的理化性质、蛋白亲水性/疏水性值均未发生变化。

2.5 麻城黑山羊MC4R的亚细胞定位、信号肽以及跨膜结构分析

预测MC4R蛋白定位于细胞膜，其有信号肽的可能性较小（0.309%）。所有突变体的信号肽及亚细胞定位预测结果未见明显变化，说明突变体可能不会引起MC4R蛋白信号肽及细胞定位的改变。

跨膜结构螺旋区对蛋白质功能的作用非常重要。分析MC4R蛋白的跨膜结构发现，MC4R蛋白有7个跨膜结构，属于跨膜转运蛋白（图4）。跨膜片段分布见表3。所有突变体的跨膜结构没有明显改变。

图4 麻城黑山羊MC4R跨膜区

表3 跨膜片段信息

2.6 麻城黑山羊MC4R的糖基化位点以及磷酸化位点预测

麻城黑山羊MC4R的N-糖基化位点预测结果见图5，可能有5个N-糖基化位点，分别位于第2、17、26、97、108位的天冬酰胺残基，表明MC4R蛋白可能具有N-糖基化机制。O-糖基化位点预测结果见图6，共有10个O糖基化位点，说明MC4R蛋白可能具有O-糖基化机制。磷酸化位点预测结果见图7，发现20个丝氨酸位点，6个苏氨酸位点，1个赖氨酸位点，其对应激酶见表4。突变体的蛋白糖基化、磷酸化位点与野生型未见不同。

图5 N-糖基化位点预测

图6 O-糖基化位点预测

图7 磷酸化位点预测

表4 磷酸化位点对应激酶

2.7 麻城黑山羊MC4R蛋白的二级结构预测分析

麻城黑山羊MC4R蛋白的二级结构分析结果见图8，黑色为α螺旋，蓝色为β折叠，红色为无规则卷曲。其中α螺旋占53.7%，β折叠占6.2%，无规则卷曲占0.8%。对麻城黑山羊8个MC4R突变体的二级结构预测发现，C617A、C649G两个突变体的二级结构发生变化，C617A突变体α螺旋变为26.6%，β折叠变为6.33%、无规则卷曲变为2.37%，其余6个突变体对蛋白质的二级结构无变化。

图8 麻城黑山羊MC4R二级结构预测

2.8 构建麻城黑山羊MC4R蛋白的系统进化树

利用NCBI中绵羊、人、猪、犬、牛等物种的MC4R氨基酸序列及麻城黑山羊MC4R氨基酸序列进行多重比对，构建不同物种的系统进化树，结果见图9。由图9可知，麻城黑山羊MC4R氨基酸序列与绵羊的相似性为97.82%，与牛的相似性为94.50%，说明MC4R是保守蛋白，且麻城黑山羊与绵羊的MC4R处于一个分支，与牛的亲缘关系较近，与鸡的亲缘关系最远。

图9 不同物种MC4R蛋白的系统进化树

2.9 MC4R蛋白的互作蛋白预测

在STRIG交互式数据库中搜索可能与MC4R蛋白相互作用的蛋白时发现，MC4R蛋白与POMC、NPS、IAPP、GCG、AGRP、GLP1R、GNB3、GIPR、CRHR1、CRH可能存在相互作用。

图10 麻城黑山羊MC4R蛋白相互作用的蛋白预测

3 小结与讨论

作为促肾上腺皮质素的受体，MC4R可介导肾上皮质腺类固醇的合成，参与其代谢及信号转导过程，在调控糖脂代谢和胰岛素分泌方面发挥重要作用。MC4R基因变异与人类较低的内脏脂肪积累和较高的餐后碳水化合物利用率具有关联性［11］。敲除MC4R基因的小鼠，患有食欲亢进和肥胖［12］。MC4R还与葡萄糖稳态有关［13］，大鼠MC4R缺乏会使葡萄糖代谢累加，导致糖尿病［14］。MC4R可以与一些配体结合发挥调控体脂代谢的作用。如MC4R可以与天然内源配体α-MSH结合，从而抑制体重的增加［2］。MC4R还能高亲和地与外源药物激动剂setmelanotide结合，为瘦素受体缺陷型患者提供持久的减肥［15］。

MC4R基因在调控畜禽生长发育方面的研究较多。在杜洛克和地方品种猪杂交配种群中，MC4R基因影响脂肪酸的组成［6］。绵羊MC4R基因G1232A突变影响出生体重、断奶体重和脂肪厚度［16］，G1232A突变与背膘厚度显著相关［17］。MC4R是影响鸡早期生长和肌肉性状的主效基因［18］，不同MC4R基因型与鸡体重极显著相关［8］。江香猪G1392A突变导致精氨酸变为组氨酸，影响猪生长性状和背膘厚度［19］。秦川牛A129G突变影响牛活重，C1069G突变与活重、屠体重、背膘厚、大理石纹显著相关［7］。MC4R基因的多态性在育种过程中有潜在应用价值，是非常重要的分子标记。

麻城黑山羊MC4R基因有999 bp的完整CDS，编码332个氨基酸，与绵羊的序列相似性达到97.82%。MC4R的互作蛋白主要有AGRP、CRHR1、GLP1R、GCG等，其中AGRP是机体内维持代谢稳态和能量平衡的重要神经元，对调节基础代谢率、摄食、脂肪和糖代谢起重要作用［20］；GLP1R是胰高血糖素样肽1受体，与cAMP信号通路、胰岛素分泌有关［21］；GCG是胰高血糖素，与胰岛素分泌、胰高血糖素信号通路有关［22］。因此，作为重要的配体，MC4R基因与血糖升高、体脂肪变化、能量代谢有密切关系［23］。本研究发现MC4R基因在麻城黑山羊中存在8个突变位点，并且C617A位点突变后会引起蛋白质理化性质以及蛋白二级结构发生变化。后期将针对这些突变位点，深入研究其配体结合能力、信号转导功能，开展性状关联分析，阐明不同MC4R突变体对麻城黑山羊生长性状的影响。

研究成功克隆麻城黑山羊MC4R基因序列，获得了8个MC4R突变位点。生物信息学分析结果显示，麻城黑山羊MC4R基因在哺乳动物中保守性较强。其理化性质和蛋白结构功能预测表明MC4R基因及其突变体很有可能参与麻城黑山羊血糖调控，体脂变化、能量代谢等生长代谢过程。