骨骼发育不良的遗传学研究进展*

吴南

（1.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京 100730；2.骨骼畸形遗传学研究北京市重点实验室，北京 100730；3.疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100730；4.中国医学科学院脊柱畸形大数据研究与应用重点实验室，北京 100730）

骨骼发育不良（skeletal dysplasia，SD）是一类影响骨和软骨组织组成与结构的发育性疾病，其表现包括巨头畸形、面中部发育不良、肢端畸形、身材矮小、关节松弛、脊柱侧凸、骨密度异常等，亦可合并其他系统畸形。SD 的出生患病率约为1/5 000，表型严重程度不等，其中成骨不全和软骨发育不全相对常见，而致死的骨骼发育不良多因胸骨发育不全、肺无法正常发育，导致婴儿死于呼吸窘迫[1]。由于SD的某些致病基因不仅在骨骼系统发挥作用，所以SD 患者的听力、视力和神经系统等亦会受累[1]。2019 年，国际骨骼发育不良学会根据临床、影像、分子表型将SD划分为461 种、42 类[2]。该年修订的最新版Nosology and classification of genetic skeletal disorders囊括了437种致病基因，较2015年版新增了73种[2,3]。

1 骨骼发育不良的分子遗传学研究前沿进展

面对表型复杂多样的SD，分子遗传学检测可帮助临床医师鉴别诊断疾病的类型和病因。其中成骨不全、综合征性脊柱侧凸和先天性肢端畸形近年来在分子遗传学方面取得了较多突破性的进展。

1.1 成骨不全

成骨不全（osteogenesis imperfecta）又名脆骨病，以骨量低下、骨骼脆性增加和反复骨折为主要特征，亦可出现身材矮小、蓝色巩膜、牙本质发育不全等临床表现[4]。1979 年，Sillence 等[5]根据临床严重程度将其为4类亚型，之后发现的Ⅴ型成骨不全则具有肥厚性骨痂、骨间膜钙化等独特临床表现，此分类未考虑遗传因素。已知超85%的成骨不全是由编码Ⅰ型胶原蛋白α1 链的COL1A1或编码α2 链的COL1A2突变所致，为常染色体显性遗传[6,7]。

近年来，随着测序技术的发展，除COL1A1/2外，又发现了二十余个导致成骨不全的基因，为常染色体显性、隐性或X连锁遗传[8]。2018年，Doyard 等[9]报道了在4 位成骨不全患者身上发现的FAM46A纯合突变，表明FAM46A突变可导致伴有先天性下肢弯曲的表型严重的成骨不全。2020年，Dubail等[10]在两个无血缘关系家族中的三位患者中发现CCDC134纯合功能缺失突变导致严重的Ⅲ型成骨不全。此外，近年来已报道的可导致成骨不全的基因还包括CRTAP、CREB3L1、IFITM5、LEPRE1、P3H1、PPIB、SERPINF1、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、WNT1、SPARC、MBTPS2、MESD、SEC24D、P4HB、PLOD2、PLS3和KDELR2等[8,11]。这些基因涉及胶原蛋白的合成、加工和交联或影响成骨细胞的分化和功能，致病的具体分子机制尚未完全清楚，但它们通过各种机制最终影响了Ⅰ型胶原蛋白的质量或数量[6,8]。2019 年，Maioli 等[12]报道了在394 例意大利成骨不全患者中进行的基因型表型关联分析结果，指出影响Ⅰ型胶原蛋白数量的突变多导致Ⅰ型成骨不全，而影响胶原蛋白功能的突变与Ⅱ～Ⅳ型成骨不全显著相关。随着越来越多致病基因的发现，为了精确成骨不全的分类，推动基因靶向治疗的研究，学者们将致病基因纳为成骨不全分型的依据。Forlino等[6]指出可以根据致病基因影响的代谢途径将成骨不全分为五类，前三类分别影响胶原蛋白的结构和加工、翻译后修饰、折叠和交联，第四类影响骨化或矿化，第五类会造成成骨细胞分化缺陷。

1.2 综合征性脊柱侧凸

近期我们通过大规模全外显子组测序发现约10%的早发型脊柱侧凸患者为综合征性脊柱侧凸（syndromic scoliosis），致病基因包括NF1、FGFR3、PLOD1等[13]。典型的具有脊柱侧凸表现的综合征包括结缔组织疾病，如马方综合征（Marfan syndrome）和Ehlers-Danlos 综合征（Ehlers-Danlos syndrome），以及1 型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1），Prader-Willi综合征（Prader-Willi syndrome）等。

1.2.1 马方综合征

是一种累及骨骼、心血管及眼三大系统的常染色体显性遗传病，主要表现为主动脉瘤和夹层、晶状体异位、蜘蛛样指（趾）、身材瘦高、关节活动过度、胸廓畸形、脊柱侧凸或后凸畸形，也可累及神经系统、皮肤和肺[14,15]。超90%的患者存在FBN1突变，FBN1位于15q21.1，总长度为200 kb，编码长度为8 kb，包含66个外显子，编码原纤维蛋白-1，致病机制为单倍剂量不足或显性负效应[16]。

近期研究表明，FBN1基因第65/66 外显子杂合突变的患者除典型的马方症状外，还有严重的脂肪营养不良，称为马方样-早衰样-脂肪营养不良综合征（marfanoid-progeroid-lipodystrophy syndrome，MPLS）[17]。2021年，Arnaud等[18]报道了在1575例马方综合征患者的队列进行的基因型表型关联分析结果，研究发现FBN1终止突变（premature termination codon mutations，PTC）的患者有更严重的主动脉表型，且预期寿命更短，而具有框内突变（in frame muta⁃tion）的患者根据突变对半胱氨酸数量的影响具有不同的特征，其中半胱氨酸减少的患者各系统受累更为严重。临床诊断马方综合征需综合考虑眼、心血管和骨骼系统的累及程度、家族史和是否携带致病FBN1突变[19]。

1.2.2 Ehlers-Danlos综合征

是先天性结缔组织发育不全性疾病，主要症状为皮肤弹性过强、关节活动度异常增大和血管等组织脆性增加[20]。2017年，Malfait 等[21]制定了最新版的Ehlers-Danlos综合征国际分类标准，以临床表现为主要根据将其分为13 种亚型，同时强调了分子诊断的重要性。13 种亚型中，除hypermobile Ehlers-Danlos综合征外，其余亚型均已明确分子机制[21]。其中，ky⁃phoscoliotic Ehlers-Danlos 综合征（kEDS）具有脊柱侧后凸的表型，是由PLOD1纯和或复合杂合突变引起的[22,23]。PLOD1基因编码赖氨酸羟化酶，对胶原的正常形成至关重要。

2018 年，Giunta 等[24]报道了一个17 人的kEDS 队列，表明FKBP14的双等位基因突变也会导致kEDS。PLOD1和FKBP14突变导致的kEDS 临床特征一致，不易区分，但FKBP14-kEDS 患者具有听力障碍。2019年，Lim等[25]利用原始皮肤成纤维细胞对两类kEDS进行了转录组分析，发现编码细胞外基质的基因存在显著的表达差异。研究者还通过定量RT-PCR验证了FKBP14-kEDS患者中ALDH1A3的表达增强，而ALDH1A3与听力障碍之间存在分子联系，这值得进一步探究[25]。

1.2.3 1型神经纤维瘤病

是累及皮肤、骨骼、神经、心脏、眼等多个系统的常染色体显性遗传病，多发牛奶咖啡斑和神经纤维瘤是其特征性表现，脊柱侧凸是其最常见的骨骼表现[26]。1 型神经纤维瘤病的致病基因是位于17q11.2的肿瘤抑制基因NF1，该基因编码神经纤维瘤蛋白。神经纤维瘤蛋白在神经元、神经胶质细胞等多种细胞中表达，是一种GTPase 激活蛋白（GTPase-activat⁃ing protein，GAP），可激活GTPase 进而催化有活性的RAS-GTP 转化为非活性的RAS-GDP，从而抑制Ras活性[27]。NF1突变导致神经纤维瘤蛋白失活进而增强RAS 信号以及其下游的丝裂原激活蛋白激酶（mi⁃togen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）等效应通路，导致细胞的异常增殖和分化[27,28]。

近年来，随着测序技术的发展，NF1基因靶向测序和致病突变的分析成为鉴别诊断1 型神经纤维瘤病的新手段。2018年，Wu等[29]对100例疑似1型神经纤维瘤病的患者进行靶向测序，检测到73 个NF1突变。2020 年，Bianchessi 等[30]同样利靶向测序对250例疑似1 型神经纤维瘤病的患者进行检测，发现有168例患者携带NF1致病突变。

此外，近年来针对NF1所影响的下游信号传导通路研发的靶向药物也取得了巨大的成功。2016 年，Dombi 等[31]进行了一项Ⅰ期临床试验以确定口服MAPK 激酶的选择性抑制剂：司美替尼（Selumetinib）的最大耐受剂量并评估其血浆药代动力学，该试验纳入24例1型神经纤维瘤病患者。实验结果显示该药物可以缓解患者的疼痛、减轻患者外形异常和身体功能障碍，并且未发现过度的毒副作用[31]。2020年，司美替尼成为首个被美国FDA批准上市的治疗1型神经纤维瘤病的靶向药物[32]。

1.3 先天性肢端畸形

先天性肢端畸形包括短指（趾）（brachydactyly，BD）、并多指（趾）（synpolydactyly，SPD）和巨指（趾）畸形（macrodactyly）等。BD分为A～E五型，各型又含若干亚型，多为常染色体显性遗传[33]。

多年来的研究发现了许多导致BD的致病基因，吕赵劼等[34]对此进行了总结，包括IHH、GDF5、BMPR1B、BMP2、ROR2、HOXD13和PTHLH等多个基因[34]。SPD为常染色体显性遗传，HOXD13突变、FBLN1基因断裂均可导致SPD[35]。2019年，Du等[36]在中国一个六代的家系中证明了TTC30B与SPD 相关。巨指（趾）畸形的机制尚未充分明确，已知的致病基因有包括PIK3CA、AKT1等[37,38]。2020年，我们的一项研究纳入24 例单纯性巨指（趾）畸形的患者，通过下一代测序发现所有患者均携带嵌合型PIK3CA或AKT1突变[39]。近年的两项研究探索了PIK3CA突变导致巨指（趾）畸形的具体机制：Sun等[40]发现PIK3CA激活突变会上调E2F2，进而促进脂肪在巨指（趾）处的累积。Cui 等[41]发现PIK3CA 激活突变可通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进巨指（趾）处的骨髓间充质干细胞的分化成骨。

2 遗传检测的临床应用

探索和明确SD 的致病基因和分子机制，可帮助临床医师鉴别诊断疾病的类型和病因，也是研究改进治疗方案、开展遗传咨询和产前诊断的基础。

根据致病基因对表型复杂的SD进行分类有利于临床上进行精确诊断。如马方综合征、EDS等这类临床表型复杂且具有重叠性的疾病，分子诊断已成为了明确诊断的必要依据[19,21]。面对临床表型相似但疾病进程存在明显差异的疾病，明确的分子诊断可以帮助医师选择治疗方案、决定临床管理方案。例如NF1突变和SPRED突变的患者都会出现咖啡斑和腋窝雀斑，但是其罹患肿瘤的风险明显不同，因此通过分子诊断鉴别两基因突变分别导致的1 型神经纤维瘤病和Legius综合征十分必要[42]。2019年，Giuglia⁃no 等[43]对281 名具有神经皮肤异常表型的患者采取了靶向测序和多重连接探针扩增技术（multiplex liga⁃tion-dependent probe amplification，MLPA）等技术手段进行检测，发现分别有73.3%和2.8%的患者具有NF1和SPERD突变，成功区分了一部分只有色素沉着表型的患者。2019年，通过建立基因组-表型关联分析，我们根据致病基因定义了一种全新的先天性脊柱侧凸亚型——TBX6相关先天性脊柱侧凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）[44]。在此之前，我们的研究发现约10%的先天性脊柱侧凸是由TBX6无效突变联合一个亚效等位基因共同导致的[45]。目前，我们开发的TACS 分子诊断及临床风险评估模型已融入临床诊疗流程，实现了TACS的精准预测，提升了检测效率，降低了检测成本[46]。

明确的致病机制有利于推进靶向药物的研发，改进治疗方案。除了司美替尼，近年来还有许多靶向药物已经研发成功并获批上市。布罗索尼单抗（Burosumab）是治疗X 连锁低磷血症（X linked hypo⁃phosphatemic rickets，XLH）的靶向药物，临床试验表明该药物可以改善儿童和成人患者的身体机能、生化指标并减轻疼痛，且治疗效果显著优于常规治疗[47-49]。Burosumab 在2018 年被FDA 批准上市[50]，并在2021 年1 月获批在中国上市。此外，用于治疗骨质疏松的地舒单抗（Denosumab）和用于治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的托法替布（Tofaci⁃tinib）已广泛应用于临床[51,52]。

遗传咨询可帮助患者正确认识疾病，了解自身或后代的遗传风险。通过了解患者的家族史，结合考虑其所患疾病的遗传模式和分子机制，可建议患者选择靶向测序、全外显子组测序（whole exome se⁃quencing，WES）或全基因组测序（whole genome se⁃quencing，WGS）以明确致病基因，进行针对性的靶向治疗。对于有生育需求的患者，可告知其遗传风险，必要时建议其选择体外受精，进行植入前胚胎遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）[53]。对于选择自然受孕的患者，也应建议其在孕早期利用WES 等手段进行产前诊断[54]。基于前期的研究和临床工作基础，我们在北京协和医院开设了骨骼畸形遗传门诊，可为患有SD 等骨骼系统相关遗传性疾病的患者提供咨询。

3 展望

近年来，SD 的分子遗传学研究取得了诸多突破性的进展，但目前仍有一定占比的SD 患者缺乏分子诊断，SD 的致病基因库仍待丰富和完善。随着基因测序技术的快速发展，测序通量和深度显著提升，而测序成本大幅降低。WES 和WGS 等新一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术被愈加广泛地应用于SD患者的分子诊断。相较于WES，WGS可以准确检测出内含子和非编码区的异常，具有广泛的应用前景。2020 年，Turro 等[55]分析了一万三千多名罕见病患者的WGS数据，发现了4个非编码突变，它们通过影响其他基因的转录导致疾病的发生。Thavebthiran 等[56]对1318 例原发性免疫缺陷（primary immunodeficiency，PID）患者进行了WGS，发现调控区的缺失与疾病的发生相关。通过全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），研究人员进一步发现位于PTPN2和SOCS1位点的常见变异影响了PID患者的外显率和表现度[56]。由此可见，将WGS应用于SD患者的分子诊断有望帮助研究人员揭露新的更为复杂的SD致病机制。

随着SD 致病基因库的丰富和完善，未来可以利用分子分型对表型复杂的SD患者进行更为精细准确的分类。致病机制的不断揭示，也会为将来治疗手段的研发提供夯实的理论基础。