缺氧诱导因子-1/2在肝细胞癌中的研究进展

郭海鑫，胡唯伟，杨勇，陈真

(中国药科大学，江苏 南京 210009)

肝癌(liver cancer)是2018年全球第六大癌症和第四大癌症死因，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占到原发性肝癌的75%～85%[1]。2019年1月国家癌症中心公布了2015中国癌症数据，数据显示，恶性肿瘤已经成为我国国内居民首要的死亡原因，其中，肝癌的发病率高居第四位，其死亡率更是仅次于肺癌，居第二[2]。包括肝细胞癌在内的实体瘤的发生发展除了受肿瘤细胞自身的内在因素控制外，肿瘤细胞所处的生长环境也会对肿瘤产生重要的影响[3]。

自1955年，Thomlinson等通过对肺癌患者癌巢组织的研究后，第一次提出肿瘤缺氧的概念以来，经过近70年的临床病理分析及实验室体内外研究的证实，肿瘤细胞生长在一种高度缺氧的环境内，并且这种现象是广泛存在于各种实体瘤中。缺氧作为肿瘤微环境的一种特征，肿瘤细胞通过启动一系列转录因子，不仅使肿瘤适应了低氧的生长环境，还能参与到肿瘤的增殖凋亡、侵袭转移、表型的决定、血管生成、能量代谢和肿瘤耐药、放化疗抵抗以及病人的预后程度等进程中。在这一系列的转录因子中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是一种调控与氧相关的核心转录激活因子。肿瘤细胞在缺氧条件下通过缺氧诱导因子激活下游众多信号通路，促进了肿瘤细胞的恶性程度[4-5]。本文主要聚焦在目前研究热度相对比较高的缺氧诱导因子家族中的HIF-1α和HIF-2α，综述了HIF-1α和HIF-2α在肝细胞癌发生发展过程的作用及临床现状。

1 缺氧诱导因子(HIFs)概述

1.1 HIFs的结构和分类 HIFs是一个异二聚体结构蛋白，属于PAS(Per/Amt/Sim)结构域家族。它由两个均具有螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix，bHLH)结构的氧敏感型的α亚基和氧不敏感型的β亚基组成[6-7]。目前，已发现的缺氧诱导因子家族有3个亚型，分别是HIF-1、HIF-2、HIF-3，三者均是由α亚基和β亚基组成[8]。现有研究主要集中在发现比较早且生物活性相对明确的HIF-1α和HIF-2α中，对HIF-3α研究相对较少。

在HIFs蛋白3个不同亚型的α亚基中均含有氧依赖降解区(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)，这是对氧敏感的关键区域，也是蛋白结构中唯一能够感知氧气浓度变化的亚单位，不仅决定着HIF蛋白的稳定性，同时也决定了蛋白的生物活性。在HIF-1α和HIF-2α中，分别在N端和C端均具有一个反式转录活化结构域(transactivation domains，TAD)[9]。二者在N端的反式转录活化结构域(N-TAD)的不同，直接导致特异性的调节不同靶基因，同时N-TAD与ODDD存在重叠，因此在调节蛋白稳定以及维持生物活性方面起着重要的作用。C端的反式转录活化结构域(C-TAD)能够与p300/CBP结合后共同启动缺氧条件下的转录。

β亚基属于结构性亚基，其中发现最早的研究最多的是HIF-1β亚基。HIF-1β又称芳香烃核转位子(aryl hydrocarbon receptor translocator，ARNT)。其蛋白表达不受氧影响，能够持续性的表达。因为HIF-1α和HIF-2α在蛋白结构和序列上存在高度相似，所以二者都能够与HIF-1β形成不同的异二聚体。

1.2 HIFs的氧调节机制 HIFs蛋白的生理功能主要由氧敏感型的α亚基调控，因此在众多对HIFs的研究中，主要是针对具有生物活性的HIF-α亚基。同样，HIFs蛋白的凋亡一般也是指发挥主要生物活性的由氧调控的HIF-α亚基的凋亡。含氧(或常氧)时，在脯氨酰羟化酶(prolylhydroxylases，PHD)的作用下，N-TAD区域的ODDD区域的脯氨酸残基被羟化。羟化后的脯氨酸残基能够被肿瘤抑制蛋白pVHL(von Hippel-Lindau protein)识别捕获，pVHL能够被E3泛素连接酶配体所识别，组成泛素连接酶复合物，从而介导HIF-α亚基进入泛素蛋白酶体途径降解。缺氧(或低氧)时，PHD表达量减少，使得HIF-α亚基的ODDD区域脯氨酸残基羟化水平降低，减少了与pVHL的结合，泛素化降解途径受到抑制，从而使得HIF-α亚基表达量上升。HIF-β亚基在结构上不含ODDD结构域， 因此HIF-1β亚基的表达不受氧气含量的影响，在常氧或缺氧时均能够稳定表达。在缺氧时，HIF-1α或HIF-2α易位至细胞核内，与HIF-1β在核内结合形成异二聚体后，与p300/CBP进一步结合形成具有转录活性的HIF转录复合物，启动相应靶基因的转录调控[10-11]。

有研究发现，在缺氧条件下，肿瘤中首先出现显著上调的是HIF-1α，其表达峰值出现在缺氧后4 h。当长时间缺氧后，HIF-1α的表达量下降，同时HIF-2α表达量上升[12]。同时，由此可见，HIF-1α与HIF-2α存在着一定的反馈机制。急性缺氧条件下，以HIF-1α表达为主，在长时间的慢性缺氧条件下是以HIF-2α表达为主[4]。

1.3 缺氧诱导因子的靶基因 HIF-1α和HIF-2α在结构和序列上有着高度的相似性，并且都具有结合靶点基因启动子中的缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)，因此二者在下游调控上存在着一些共同的靶基因，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、 白细胞介素-6(IL-6)、葡萄糖载体蛋白-1(GLUT-1)、肾上腺髓质素(ADM)、脂肪细胞分化相关蛋白 (ADPR)等[13]。但因二者在缺氧条件下存在着一定的负反馈调节机制，表达量有所差异，以及结构序列上的差异，所以它们的所介导的共同的靶基因调节模式有所不同。也因此，二者存在着一些各自特异性的靶基因。如胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、内皮素-1(ET-1)、血小板源性生长因子(PDGF)、血红素氧合酶-1(HO-1)、诱导型NO合酶(iNOS)等均是 HIF-1α的特异性靶基因。细胞周期蛋白(cyclin D1)、转化生长因子-α(TGF-α)、VEGF受体-2(Flk-1)、干性转录因子Oct-4等则是受到HIF-2α调控的特异性调控的靶基因。这些共有的和特异性的靶基因均是肿瘤在恶性发展过程中的关键性靶点。

2 缺氧诱导因子与肝细胞癌

肝细胞癌主要是由肝硬化引起，其由包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)，酒精性脂肪肝(ALD)和病毒性肝炎在内的慢性肝病发展而来，这些慢性肝病中大部分都存在组织缺氧的特征[14]。目前HCC的治疗选择非常有限，加上HCC患者确诊时大部分都已经是晚期，只有少数HCC早期阶段的患者可以通过肝切除或移植等手术治疗手段治愈。但是，其中近一半左右的患者在切除后会发生肿瘤的复发和转移。同时，临床上HCC晚期的患者对化疗存在很强的抵抗。

缺氧条件下肿瘤内的HIF-1α和HIF-2α的转录和活化导致了下游大量的基因的表达被上调。大部分基因所编码的蛋白参与到了肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移、代谢、血管生成，同时也影响了肿瘤的耐药性。

2.1 缺氧诱导因子调控肝细胞癌机制 临床病理及目前已有报道，在HCC组织中HIF-1α癌巢的表达水平均高于癌旁组织，但对于HIF-2α的表达与癌巢组织的关系仍然存在争议[15-16]。另外，HIF-1α或HIF-2α的高表达水平与较差的肿瘤分级、静脉血管浸润、肝内转移和包膜浸润有关。同时，因为二者的高表达也与无病期短和较低的生存率相关，所以HIF-1α和/或HIF-2α也可作为HCC不良预后的检测标志物。 此外，也有临床报道，HIF-1α的遗传变异与HCC发生和预后也存在相关，也可因此将其作为检测的生物标志物。这些临床结果提示HIFs在HCC发生和发展中发挥着重要作用。

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HCV)阳性的HCC患者中，HIF-1α的表达量要显著高于高于阴性HCC患者，同时HBV中的HBx蛋白表达量与HIF-1α表达也呈现正相关[17]。除此以外，HIF-1α通过介导生长因子，如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)和胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)等促进肿瘤细胞的增殖以及血管新生。同时这些细胞因子的与它们相应酪氨酸激酶受体结合后也会通过PI3K/AKT或Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在缺氧条件下促进HIF-1α的生成，形成反馈机制，加速肿瘤恶化。除了生长因子外，也有研究报道肾上腺素受体β2(ADRB2)蛋白以AKT依赖形式稳定HIF-1α蛋白促进HCC的增殖[18]。另外，热休克蛋白HSP90通过调节HIF-1a表达也能够促进HCC的增殖并且抑制细胞凋亡[19]。虽然HIF-2α转录的靶基因有促进细胞增殖的周期蛋白，但是目前对于HIF-2α在HCC增殖方面的作用仍然存在争议。有研究报道，HIF-2α能够通过E2F1信号途径抑制HCC的增殖，促进HCC凋亡[20]。

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肿瘤的转移是许多HCC患者发生不良预后的主要原因，而上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞发生转移的必要条件。HIF-1α和HIF-2α能够直接下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)促进肿瘤细胞向间充质细胞转化，以获得转移能力[21-22]。同时，HIFs也能通过诱导诸如Snail、Twist-1、Twist-2等E-Cadherin抑制因子来促使肿瘤细胞加快EMT进程[22-23]。有研究报道，在持续性缺氧状态下的HCC细胞的坏死碎片可以诱导M2型巨噬细胞释放IL-1β，IL-1β通过与环氧酶-2结合，上调HIF-1α，从而促进HCC细胞的EMT进程[24]。最新的研究发现，HCC中HIF-2a能够被lncRNA NEAT1激活从而在慢性缺氧条件下促进EMT[25]。

除了肿瘤细胞通过自身发生EMT外，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是影响肿瘤细胞发生转移的另一关键因素。MMPs能够降解肿瘤细胞的组织学屏障胞外基质(extracellular matrix，ECM)，从而使肿瘤细胞脱离原发病灶，进入循环系统，加速肿瘤的转移。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中降解ECM最主要的成员。已有报道，HCC缺氧条件下确实MMP-2高表达[26]，并通过siRNA技术沉默HIF-1α基因后能够显著的减少MMP-2和MMP-9的蛋白表达[27]，由此可见缺氧条件下HIF-1α能参与调控MMP-2和MMP-9，促进肿瘤的形成转移灶。

HCC细胞是一种高代谢的肿瘤细胞，对葡萄糖的消耗要高于一般的正常细胞。这种高代谢特征则是通过糖酵解的方式来维持。甚至在富氧条件下，肿瘤细胞通过进行有氧糖酵解来更加快速地获取更多的ATP，即肿瘤细胞的瓦氏效应(Warburg effect)。HIF-1α通过特异性的转录激活一系列与糖酵解相关的靶基因，例如葡萄糖转运蛋白GLUT-1、GLUT-3以及糖酵解酶GAPDH、HK1、HK2、PFKL、PGK1、PKM2、ALDOA、ENO1和 LDHA等，极大地提高糖酵解效率，促进了瓦氏效应[28]。在缺氧条件下，肿瘤细胞会发生无氧糖酵解，即巴斯德效应(Pasteur effect)。已有文献报道HIF-1a是巴斯德效应中核心转录因子，在缺少HIF-1a的前提下，肿瘤细胞无法在缺氧环境中完成无氧糖酵解以满足高代谢所需的ATP，从而使肿瘤细胞凋亡[29]。

2.2 缺氧诱导因子促进肝细胞癌耐药 目前，多激酶抑制剂索拉菲尼(Sorafenib)和乐伐替尼(Lenvatinib)是仅有的两个FDA批准的用于治疗晚期HCC的一线化疗药物，但它们对改善HCC晚期患者整个生存期的作用也很有局限。因此，在目前并无更多更好的化疗药物供患者选择的前提下，为了更好的利用有限的治疗药物，了解它们在HCC中的耐药机制尤为重要。

Sorafenib是一种多靶点激酶抑制剂，可以通过靶向抑制酪氨酸激酶受体如VEGFR和PDGFR等抑制肿瘤血管生成，同时也能够抑制胞内丝氨酸/苏氨酸激酶而抑制肿瘤细胞的增殖。但临床中，一方面，由于原发性耐药的原因，HCC晚期患者中只有少数患者对Sorafenib响应。另一方面，在对Sorafenib响应的患者中，Sorafenib仅能延长患者3个月左右的生存期，之后就会因获得性耐药对其产生抵抗。

Sorafenib通过阻断HIF-1α/VEGF途径减少肿瘤血管生成，造成HCC的供养和供氧不足，以此阻止HCC细胞增殖和迁移侵袭[30]。虽然一定程度上通过“饥饿”手段杀伤了肿瘤细胞，但长此以往，使得更耐缺氧和饥饿的HCC细胞存活下来，大大的降低了Sorafenib后期的治疗效果[31-32]。P-糖蛋白在化药抵抗中扮演着重要的角色，它与化疗药物结合后形成的复合物会被细胞外排，有研究直接敲低HIF-1α后发现可降低P-糖蛋白的表达[33]，提高Sorafenib的利用效率。ADRB2也能够通过HIF-1α调节糖酵解方式使HCC或者Sorafenib的抵抗性[18]。除此以外，缺氧还能诱导Yes相关蛋白(Yes associated protein，YAP)的核转位，增强HCC细胞的干性和抗凋亡能力使其存活下来。由于HIF-1α和HIF-2α之间存在相互调控的关系，Sorafenib对HIF-1α/VEGF的抑制，会促使HIF-2α的表达增加，激活TGF-α/EGFR途径，以此补偿Sorafenib通过HIF-1α/VEGF通路对HCC的杀伤作用[34]。另有研究报道，COX-2/PGE2轴能够调节HIF-2α，降低HCC对Sorafenib的抵抗[35]。另外，还有研究报道HIF-2α还能够直接转录调控多药耐药(multi-drug resistance，MDR)相关基因MDR-1、MRP-1及LRP[36]。这些耐药基因除了能够加速化疗药物的外排，降低化疗药物的治疗效果外，还与肿瘤的增殖、迁移、侵袭等生理功能相关。Lenvatinib是在2018年才被批准用作治疗HCC晚期患者一线治疗药物，因此目前对Lenvatinib的HCC耐药研究机制研究相对较少。

2.3 缺氧诱导因子与肝细胞癌治疗 HIFs能够以直接或间接的方式参与到HCC的发生发展以及耐药过程中，因此，靶向抑制HIFs联合现有一线药物的治疗会是HCC治疗的一个新的突破口，有望因此改善晚期HCC患者生活质量，延长生存期。

BAY87-2243是拜耳公司(Bayer)开发的一种通过特异性抑制HIF-1α和HIF-2α累积的HIFs抑制剂。2011年Bayer启动了BAY87-2243的临床试验(NCT01297530)，但在2013年，BAY87-2243的临床试验被Bayer主动终止。在肝细胞癌治疗方面，有研究通过组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂与BAY87-2243联用，能有更加有效的抑制HCC迁移侵袭[37]。

拓扑替康(Topotecan)是HIF-1α特异性抑制剂，能够阻止HIF-1信使RNA的翻译。目前已经完成了用于HCC的治疗的I期临床试验[38]。

PT2385是HIF-2α特异性抑制剂，可通过抑制HIF-2α、增加AR和抑制STAT3、Akt和ERK途径下游的激活而提高Sorafenib治疗效果[39]。

另外，姜黄素衍生物EF24，是一类非典型的HIF-1α抑制剂，通过抑制细胞分裂，诱导凋亡等其本身就具有一定的抑癌作用，是一个潜在癌症治疗药物。Sorafenib与EF24联用，EF24在缺氧条件下通过介导pVHL与HIF-1α的结合，促进HCC细胞中HIF-1α的以pVHL以来的方式通过E3泛素化途径降解以达到抑制HIF-1α的作用，降低HIF-1α的表达所带来的对Sorafenib的耐药[31]。

鉴于HIF-1α和HIF-2α之间的反馈调节机制以及二者均参与到其耐药过程中，更多的研究者开始意识到，在临床上应当选取能够同时靶向HIF-1α和HIF-2α的抑制剂，才能更加相对有效的解决由缺氧引起的耐药问题。

2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2ME2)是无生物活性的雌二醇通过儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)体内代谢的产物。它能够通过抑制HIF-α亚基蛋白合成、核易位及转录活性的方式抑制HIF-1α和HIF-2α，且人体耐受性极好。这些优势使得2ME2在抗肿瘤作用中表现出极高的价值。目前，2ME2用于治疗肿瘤已经进入Ⅱ期临床试验阶段，虽然效果并不理想，但是由于其良好的耐受性，2ME2的研究主要是集中在化疗领域。有文献报道，在缺氧条件下2ME2联合Sorafenib 用于HCC细胞的体外实验中，联合使用下能抑制HCC细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，极大提高了Sorafenib的药效[40]。

YC-1是HIF-2α/HIF-1α抑制剂。YC-1在对HIFs的抑制上，蛋白水平显著降低，而mRNA却并无变化，这说明YC-1是通过转录水平来抑制HIFs[41]。

除了小分子抑制剂外，基因技术的不断发展，siRNA、shRNA这种更加精准的基因靶向技术也进入临床中用于治疗癌症。通过siRNA或shRNA直接沉默HIFs基因，使其不表达或低表达。另外一种基因治疗手段则是反义寡核酸技术，通过反义DNA或反义RNA去识别靶基因的mRNA，干扰靶基因的蛋白翻译[42]。

3 展望

HCC患者往往在早期的时候被忽略而错过最佳治疗，被发现确诊的时候大部分患者都已经入晚期，可供选择的有效治疗药物品种少更是使得其晚期患者的治疗和生存期大打折扣。缺氧是包括肝癌在内的所有实体瘤的共性，HIFs及其所调控的下游基因的激活在HCC进程中发挥着举足轻重的作用。研究者们也开始越来越多的关注到缺氧对HCC的影响，并以此筛选了众多的HIFs抑制剂化合物，但离真正应用到临床还相差甚远。一方面是HCC患者用药的巨大需求以及现有治疗药物太少且疗效有限的窘迫局面，另一方面是HIFs在HCC进程中发挥着巨大作用，是HCC患者治疗的希望。HIFs作为一个新靶点，HCC治疗的新策略，新思路，对其作用机制仍需要不断深入挖掘。