水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展

彭钟琴，黄 璐

（广东茂名农林科技职业学院，广东茂名 525000）

淡水和海水的水体中含有多种天然存在的微生物，水产品在捕获和加工过程中也会受到污染而携带致病菌。鱼贝类等水生生物由于体表分泌含有糖蛋白的黏质物，使其成为微生物良好的培养基。鱼贝类的皮肤和鳃等部位直接与水体接触会沾染携带水体中的微生物，如弧菌、假单胞菌、黄杆菌和无色杆菌等细菌，以及甲型肝炎病毒、诺瓦病毒等病毒。当鱼贝类生物死亡后，附着在体表的微生物会大量繁殖引起水产品腐败变质，若水产品被沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌等污染，还会引发多种细菌性食物中毒。捕获后的水产品在销售过程中也会受微生物污染，如受到渔船的甲板、鱼箱、人手、加工厂环境等污染，被称为继发性污染。因此，水产品的微生物污染与食品安全有着密切的关系。水产品安全不容忽视，为了较好地控制水产品的质量安全，确保消费者的饮食安全，水产品必须经过严格的微生物检验并达标后才能进入市场[1]。

1 创伤弧菌生物学特性

创伤弧菌属弧菌科弧菌属，是革兰氏阴性嗜盐性弧菌，无芽孢，以极生单鞭毛运动，菌体大小为（0.5～0.8）μm×（1.4～2.6）μm，弯杆状。该菌在TCBS培养基中培养时，无法进行蔗糖的酵解，因而形成菌落着色呈绿色、光滑湿润、水珠样，此特性可用作快速鉴别[2]。该菌自然生存于河海交界之处，易感染各种水产动物，如鱼、虾、蟹、牡蛎、蛤、蚶及螺等，是水产养殖中重要的细菌性病原之一，对人的感染多通过污染的海产品，引起的食物中毒多发生在6—10月[3]。创伤弧菌是一种人畜共患病的重要病原菌，危害人类健康，可引起严重的原发性败血症和胃肠炎的疾病，病死率达50%以上，发病原因是人们食用了受创伤弧菌感染的海产品，或在捕捞或清洗鱼、虾、蟹、贝类时受到创伤弧菌的感染[4]。

创伤弧菌对热敏感，烹饪过程中可将其杀灭。食用未经烹饪的海鲜或海产品加工处理不彻底或因交叉污染海产品被该菌重复污染，会使创伤弧菌大量繁殖，引起创伤弧菌食物中毒。

2 创伤弧菌的检测

创伤弧菌具有高致病性危害，是水产养殖和进出口水产品重点检验检疫的致病菌。严格开展微生物检验对提高食品和水产品的质量安全，保证人体健康、维护我国的政治信誉和经济利益，促进对外贸易的发展都具有重要意义。

2020年，国家首次制订创伤弧菌的国家新标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验》（GB 4789.44—2020），引起了社会的广泛关注。该标准结合传统的生化鉴定和PCR检测对水产品中的创伤弧菌进行检测，规定了对水产品中创伤弧菌的检验方法，适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验。此前，国家颁布过两项行业标准：PCR法和实时PCR法。

2.1 常规分离鉴定

在同样条件下，用蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液作为样品处理优于用3%氯化钠的碱性蛋白胨水（APW）增菌液。HSU等[5]发现蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液，可抑制溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、大肠埃希氏菌等非目标菌的生长，用于创伤弧菌的选择性增菌培养。样品增菌后，接种于mCPC琼脂（改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E）和CC琼脂（纤维二糖-多黏菌素E）2种选择性培养基，也可接种于TCBS琼脂（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂）、SPS琼脂（磷酸盐缓冲液）、CPC琼脂、VVM琼脂、VVM琼脂或VVA琼脂等选择培养基，在（36±1）℃条件下培养（18±1）h。TCBS琼脂培养基最初主要用于分离致病菌，在pH值为8.6的条件下，牛胆汁和NaCl可抑制假单胞菌等非目标菌的生长繁殖[6]。

2.2 生理生化鉴定

因创伤弧菌有明显区别于其他弧菌的生化特征，可利用生化分析结果进行初步鉴定。创伤弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶阳性，在含8%氯化钠的蛋白胨水中不生长，而副溶血弧菌和溶藻弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶阴性，在含8%氯化钠的蛋白胨水中生长。结合革兰氏染色镜检观察形态、氧化酶试验、三糖铁试验和嗜盐性试验对可疑菌落进行初步鉴定，然后可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统做最终确证实验。目前，可采用API 20E生化鉴定试剂条或微生物鉴定分析系统（美国Biolog）等商业化产品对大量样品进行鉴定，不仅可以简化步骤还能提高鉴定的准确率。然而，创伤弧菌可能出现较多的非典型菌株，表型多样，使生理生化鉴定变得更加复杂。

2.3 免疫生物学检测方法

TAMPLIN等[7]以创伤弧菌特异性的单克隆抗体为免疫基础，建立了检测创伤弧菌的酶免疫法，检测限达2×104CFU/mL，是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）检测创伤弧菌的推荐方法之一。PARKER等[8]根据创伤弧菌分泌至胞外的一种穿孔毒素溶血素（VVH）建立了双抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）法，测定大分子抗原，溶血素（VVH）是创伤弧菌的致病毒力因子之一。ELISA检测方法是当前应用最广、发展最快的一项新技术，灵敏度高，无需复杂仪器且操作简单，应用广泛。

2.4 常规PCR检测方法

聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。HILL等[9]基于VVHA基因设计特异引物首次对创伤弧菌进行PCR检测，选用22株非目标菌株进行了特异性试验，目标菌株获得519 bp的扩增条带，而其他弧菌和非弧菌细菌无特异扩增，检测限为100 CFU/g。KUMAR等[10]根据gyrB基因设计特异引物对海产品中创伤弧菌进行了PCR检测，结果显示，目标菌株都出现一条285 bp的特异性条带，非目标菌株均为阴性结果。DNA提取前经过3%氯化钠碱性蛋白胨水进行18 h增菌处理的样品，检出限为30 CFU/g，而不经过增菌处理的样品的检出限则为300 CFU/g。

2.5 RT-qPCR检测方法

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术是重要的基因表达定量方法，具有灵敏度高、灵活度好、实验门槛低等特点，是实验室最常用的实验技术之一。王紫薇等[11]通过RT-PCR法和微生物鉴定药敏智能系统（VITEK）对在北京市市场随机采集的105份海产品进行创伤弧菌检验，经高度保守的管家基因rpoB基因测序验证，实时荧光定量PCR法和微生物鉴定药敏智能系统方法的准确率分别为100%和67.5%。

2.6 LAMP技术

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Am- plification, LAMP）技术，是一种新的DNA扩增方法，LAMP技术发展初期主要应用于食源性微生物的检测，目前已出现沙门氏菌（Salmonella）、军团菌（Legionella）、李斯特杆菌（Listeria）和弯曲杆菌（Campylobacter）等微生物的LAMP检测商品试剂盒。田卓等[12]以创伤弧菌的gyrB基因作为靶基因，优化筛选的引物特异地检测创伤弧菌，检测核酸浓度的灵敏度可以达到10-9g/L，在558份水体样品和655份水产品样品中，创伤弧菌阳性检出率分别为0.54%和0.46%，与实时荧光PCR方法的检测结果符合率为100%。

3 结语

创伤弧菌是水产品中主要的病原菌之一，近年来，有较多由该菌引起的散发病例。研究创伤弧菌的检测方法对提高食品和水产品的质量安全，保证人体健康具有重要意义。