蛋白激酶C在变应性鼻炎发病机制中的研究进展

吕浩，周方伟综述 许昱审校

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特应性个体接触致敏原后由免疫球蛋E(IgE) 介导的炎性因子释放、多种免疫活性细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞等)共同参与的鼻黏膜变态反应性疾病[1]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是由一类依赖Ca2+和磷脂激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。PKC催化的磷酸化对细胞多种生理活动必不可少，如增殖、分化等，是重要的细胞内信号转导分子[2]。PKC及其同工酶家族表达于各种免疫细胞中，如调节性T细胞(Treg)、2型辅助T细胞(Th2)、B淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等，参与调节固有免疫和获得性免疫的关键信号转导途径[3]。前期研究表明，AR患者外周血淋巴细胞中PKC的活性增高，并且与外周血中IL-4、IL-5水平呈正相关[4]。不同PKC亚型参与不同的信号通路，并且具有一定的细胞特异性。然而目前对于PKC的各种同工酶亚型在变应性鼻炎中的具体机制仍不清楚。笔者从AR的免疫学机制出发，综述PKC各家族成员在辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)、调节性T细胞/辅助性T细胞17(Treg/Th17)、B淋巴细胞、Ⅱ型固有淋巴细胞 (ILC2s)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞中的作用，以期为AR提供新的治疗思路。

1 PKC的结构及分类

根据PKC激活方式的不同及调控结构域之间的差异，将目前已知的10种PKC家族成员分为3类：经典蛋白激酶C(PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCγ)，新型蛋白激酶C(PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ)，非典型蛋白激酶C(PKCζ、PKCλ/ι)[5]。所有PKC同工酶具有共同的一般结构，由2个主要结构域组成，包括高度保守的催化结构域(由三磷酸腺苷/底物COOH-末端结合域和催化所需序列组成)和将酶维持在非活性构象的调节结构域(位于蛋白质的NH2-末端，包含1个自抑制性假底物结构域和2个离散的膜靶向序列)[5]。调节区和催化区通过铰链区(该部位对蛋白酶极其敏感)连接一起。根据分子结构，经典蛋白激酶C由5个可变区 (V区) 和4个保守区 (C区) 组成。C1是二酰甘油 (DAG) 或佛波酯(PMA)的结合位点，C2区含有酸性脂质的识别位点，并且负责结合Ca2+，C1和C2合称PKC的调节区；C3有1个ATP结合基序，为PKC提供能量和磷酸基团，C4是底物结合区，催化中心位于此区，C3和C4区合称为PKC的催化区;该组的活性取决于Ca2+、DAG和磷脂酰丝氨酸 (PS)[6]。新型蛋白激酶C在结构上与经典蛋白激酶C类似， 但其C2区不具有与Ca2+结合的酸性氨基酸残基;因此，它不依赖于Ca2+，而是需要DAG和PS来激活。非典型蛋白激酶C与前2组结构不同，C1区含有能够与神经酰胺或PIP3结合的非经典C1结构域，且缺少C2区。因此它们不能被上述第二信使激活。aPKC的PB1 (phox and bem 1)结构域能够与同样有PB1结构域的支架蛋白(包括P62、PAR-6和NBR1)结合，从而调控蛋白质的空间构象和激酶活性[7]。

2 AR发病机制

目前研究表明，AR的发病机制主要表现为Th1/Th2/Th17和Treg的免疫失衡。一般认为，AR的发病过程始于接触变应原。当变应原侵入鼻黏膜上皮后，由抗原提呈细胞(APC)摄取，被加工成小肽并与特定的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子结合，形成抗原肽—MHCⅡ类分子复合物，并表达在细胞膜表面，被CD4+初始 T细胞表面的受体和其他共刺激分子识别后，使幼稚T细胞分化为Th2细胞，并产生IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子。抗原特异性Th2细胞直接刺激B细胞，诱导其分化为浆细胞并产生抗体[8]。而IL-4可以诱导B细胞IgM抗体发生类别转换，促进IgE形成[9]。IgE与肥大细胞、嗜碱性粒细胞和APC表面的IgE高亲和力受体结合，使这些细胞对变应原致敏。当机体再次暴露于变应原，IgE-FcεRI复合物在APC上的交联有助于APC加速摄取变应原并进行加工和呈递。同样，这也引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放多种炎性介质从而在AR的发病中起作用[10]。同时，受损的鼻黏膜上皮分泌胸腺间质淋巴生成素(TSLP)、IL-33、IL-25等上皮源性细胞因子，激活Ⅱ型固有淋巴细胞释放Th2细胞因子,促进AR的进展。Th17细胞可通过促炎因子募集嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等促进炎性细胞向鼻黏膜局部募集，从而促使发生变应性炎性反应[10]。Treg细胞作为免疫调节细胞，通过释放细胞因子和细胞间接触等多种机制，直接抑制变应原特异性Th2细胞的活化[11]。

3 PKC在AR相关免疫细胞中的作用

3.1 PKC在Th2细胞中的作用 Th2反应是AR发病机制的核心。PKC家族成员在T细胞中的作用已被广泛研究，其中PKCθ的作用尤为突出。APC细胞表面的抗原肽—MHCⅡ类分子复合物与初始T细胞上的T细胞抗原受体(TCR)及共刺激分子CD28相互作用形成免疫突触，PKCθ被特异性募集到免疫突触中，随后刺激T细胞中转录因子NF-κB、AP-1、NFAT，从而引发T细胞活化、增殖、分化等一系列免疫反应[12]。此后，越来越多的研究发现PKCθ在T细胞亚群的作用。PKCθ可正向调控Th2和Th17细胞数量及功能，而对Th1细胞、细胞毒性T细胞则无明显影响。 有学者发现在OVA致敏的过敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ基因缺陷小鼠的血清及肺泡灌洗液中OVA特异性IgE水平明显降低，体外培养PKCθ缺陷型T细胞则无法产生IL-4[13]。 后续研究进一步解释了PKCθ缺陷型T细胞IL-4产生障碍的原因， PKCθ可激活CD4+T细胞NF-κB，进而促进IL-6的分泌，这诱导了CD4+T细胞IL-4的自分泌[14]。而IL-4正是诱导CD4+T细胞向Th2细胞分化及维持Th2细胞分化的关键细胞因子[15]。另一项研究揭示了PKCθ正向调控Th2细胞分化的新机制。在PKCθ基因缺陷的Th2细胞中发现GATA结合蛋白3(GATA3)表达水平明显下降，而GATA3蛋白是Th2细胞特征性转录因子[16]。这说明PKCθ也可以通过上调GATA3表达，促进Th2细胞的分化。

除PKCθ外，aPKC在变应性疾病中也起着非常重要的作用。在条件性PKCλ/ι基因缺陷小鼠(仅在活化的T细胞中PKCλ/ι缺失)中，外周血Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)明显降低，同时也观察到OVA特异性IgE血清水平显著降低[17]。而在对另一种aPKC(PKCζ)的研究中，也发现了类似的结果。在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，PKCζ基因缺陷小鼠的支气管肺泡灌洗液中Th2型细胞因子显著减少；体外实验证实PKCζ是激活JAK1/STAT6信号通路所必需的因子，该信号通路控制Th2效应子功能和IL-4受体信号传导[18-19]。

PKC不仅在诱导分化Th2细胞阶段发挥作用，而且分化成熟的Th2细胞生理活动也依赖PKC。最近一项研究表明，电压门控钙通道Cav1.2是人高度分化的Th2细胞中Ca2+响应和细胞因子产生的关键调节通道，而PKCα/β是Cav1.2钙通道下游信号通路的重要信号转导分子[20]。在OVA致敏的过敏性哮喘小鼠模型中，运用PKCα/β抑制剂G6976可降低Ca2+促发的Th2细胞活化和细胞因子产生[21]。

3.2 PKC在Th17/Treg细胞中的作用 Th17细胞主要分泌促炎因子IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等，通过调节Th2型细胞因子IL-5参与AR的发生和发展。Wachowicz等[22]发现PKCθ可促进nave T细胞向Th17细胞分化，体外实验表明 PKCθ可以激活STAT3、Th17特征性转录因子维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)及IL-17A/F基因组转录；在Th17细胞分化完成后，PKCθ通过抑制STAT4基因启动子来稳定Th17细胞表型。Sen等[23]的研究进一步揭示了PKCθ激活转录因子RORγt的分子机制。Th17细胞在分化初始时共表达转录因子RORγt和Foxp3，Foxp3直接绑定到RORγt蛋白拮抗其结合DNA，类固醇受体共激活剂(SRC1)结合RORγt可促进Foxp3从RORγt释放，随后通过泛素—蛋白酶体途径降解，从而逆转了Foxp3介导的RORγt抑制作用。而PKCθ催化SRC1 磷酸化，是促进SRC1 结合RORγt的关键步骤。此外，另有研究表明，在屋尘螨(HDM)诱导的过敏性气道炎性反应模型中， PKCλ/ι基因缺陷型小鼠较对照组小鼠支气管肺泡灌洗液中的浸润嗜酸性粒细胞数量及Th17细胞因子(包括IL-17、IL-21和IL-22)水平明显降低[24]。后续体外实验证实，PKCλ/ι亦是通过上调STAT3和RORγt蛋白表达，从而促进Th17细胞的活化。Treg细胞对于维持免疫稳态和自身耐受性具有重要作用，AR患者中Treg细胞数目及比例明显降低。有研究表明，在PKCθ基因敲除小鼠的淋巴器官中，CD25+CD4+Foxp3+T细胞的百分比降低[25]。体外实验证实，PKCθ可以通过calcineurin/NFAT通路上调转录因子Foxp3表达，从而促进Treg细胞的发育[26]。

3.3 PKC在Ⅱ型固有淋巴细胞中的作用 Ⅱ型固有淋巴细胞 (ILC2s)是一种新型固有免疫细胞，因分泌Th2型细胞因子而得名，主要分布于呼吸道、消化道等黏膜组织中，参与调节组织损伤、寄生虫、变应原等刺激后的机体反应[27-28]。目前研究表明，PKCθ信号通路与ILC2s激活密切相关。Madouri等[29]发现在过敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ对于ILC2s的激活和促进Th2型反应是必需的；敲除PKCθ基因后，小鼠肺组织中ILC2s总数量显著降低，同时分泌IL-5、IL-13的ILC2s比例也明显减少。体外实验表明，PKCθ基因缺陷型小鼠中ILC2s数量降低与IRF4、NFAT1表达减少有关。而转录因子IRF4与NFAT1协同作用可促进T细胞IL-4基因的表达及Th2细胞反应。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是最主要的ILC2s激活因子之一，激活后的ILC2s释放大量Th2型细胞因子[30]。Nomura等[31]发现在人鼻成纤维细胞中，PKCδ抑制剂可抑制TSLP的产生。

3.4 PKC在B细胞中的作用 AR患者的特征之一在于外周血中记忆性B细胞或浆细胞分化增加[32]。与PKCθ在T细胞中发挥主要作用类似，PKCβ被认为是B细胞中起关键作用的PKC同工酶。研究发现，在PKCβ基因敲除小鼠中，外周血B细胞活化、增殖、抗体产生方面存在明显缺陷[33]。随后研究表明，抗原与初始B细胞抗原受体(BCR)结合，导致受体相关酪氨酸激酶(Src家族、Syk和Btk)激活，这诱导了第二信使DAG和三磷酸肌醇的产生。受DAG刺激，PKCβ转位到BCR信号体中，激活关键转录因子Myc、NF-κB等，最终促进B细胞活化、增殖。B细胞向浆细胞分化的启动受转录因子PAX5和IRF4的双重调控[34]。最近一项研究发现PKCβ可以上调转录因子PAX5和IRF4表达，从而促进生发中心的形成和浆细胞分化[35]。综上所述，PKCβ是B细胞免疫反应的正向调节因子。因此，靶向抑制抗原特异性B细胞中PKCβ，或许是治疗AR有效的策略。

3.5 PKC在肥大细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞中的作用 肥大细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞是AR中关键的效应细胞。Ca2+动员在肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒阶段起关键作用，而PKCδ是FcεRI信号通路中Ca2+动员下游的重要信号转导分子[36-37]。在过敏性哮喘小鼠模型中，腹腔注射PKCδ特异性抑制剂rottlerin可降低支气管肺泡灌洗液中组胺浓度。另有研究表明，PKCδ可以通过非Ca2+依赖途径参与嗜碱性粒细胞的脱颗粒作用，在大鼠嗜碱性粒细胞系RBL-2H3中发现，PKCδ促进膜融合因子Munc18a在Ser313处的磷酸化，从而导致嗜碱性粒细胞脱颗粒[38]。运用PKCδ抑制剂Ro-03-0432以浓度依赖性方式抑制嗜碱性粒细胞系RBL-2H3组胺浓度。而组胺是过敏反应，特别是速发相反应中的主要炎性介质之一。其作用主要是通过靶细胞(如血管内皮细胞、平滑肌细胞、腺上皮细胞)表面组胺H1受体来介导[39]。花粉症患者鼻症状评分(VAS)与鼻黏膜中组胺H1受体(H1R)mRNA水平之间存在显著相关性[40]。Islam等[41]研究发现，PKCδ信号通路促进H1受体基因的表达。在甲苯2，4-二异氰酸酯(TDI)致敏的AR大鼠模型中，运用PKCδ抑制剂可以显著改善AR大鼠打喷嚏、流涕等症状。这些研究均表明，PKCδ通过调控肥大细胞在变应性鼻炎的发病机制中起重要作用。因此PKCδ是抗过敏药开发中一个富有前景的靶蛋白。关于PKC在嗜酸性粒细胞中的作用则知之甚少，有限的研究表明，PKCζ是唯一在嗜酸性粒细胞中发挥作用的PKC同工酶。在体外实验中，用PKCζ特异性抑制剂处理受血小板活化因子(PAF)或补体5a(C5a)刺激的人嗜酸性粒细胞后，嗜酸性粒细胞超氧阴离子及活性氧的产生明显下降；同时还发现PKCζ抑制剂减弱了嗜酸性粒细胞脱颗粒和黏附作用[42]。

4 小结与展望

综上所述， PKC是一种重要的细胞内信号转导分子，其介导AR发病的多种免疫细胞活化和功能。PKC及下游信号通路的激活参与了Th1/Th2、Th17/Treg平衡，促进嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等效应细胞活化，从而影响AR进程。然而目前为止，对PKC在变应性疾病中的研究大多聚焦于哮喘，而AR中的相关研究仍然匮乏。深入研究PKC不同亚型在AR中的调节机制，有利于为治疗AR及其他变应性疾病提供新的治疗靶点。