不同早期母婴分离模型对雌性大鼠行为的影响

张蕴曦，陈鑫钊，王家钰，赵蓓莹，韩芳

（中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，沈阳 110122）

早期生活压力在个体生长发育过程中起至关重要的作用。研究发现，抑郁的发生与儿童时期不良应激暴露密切相关［1］，受到早期生活压力影响的儿童有相当高的可能患有情绪和精神疾病［2］。母婴分离被认为是一种模拟早期生活压力的动物模型［3］。啮齿类动物研究表明，非常短暂的母婴分离可能会对后代的发育产生积极的影响，但长时间的母婴分离会造成负性影响，这种影响会在成年时表现出来，并持续终生。在啮齿类动物特别是在大鼠中，母婴分离被用作各种精神疾病尤其是抑郁症的模型。研究［4］表明，母婴分离可以造成大鼠成年后焦虑、抑郁、认知障碍等一系列异常行为。

目前最常用的建立母婴分离大鼠模型的方法是采用每天母婴分离3 h（maternal separation for 180 min，MS180）或15 min（maternal separation for 15 min，MS15），但是人们对2种分离方法对大鼠造成的行为影响存在较大分歧，尚无统一结论。一些研究［5］认为MS180会造成大鼠一系列负性行为，而MS15可以减少大鼠焦虑样行为。此外，一些研究［6］将MS15作为MS180的对照组。另一方面，在创伤后应激障碍、抑郁症等精神疾病中，有研究［7］发现雌性对精神疾病具有更高的易感性。同时有研究［8］发现，运动具有缓解焦虑、抑郁的作用。因此，本研究选取雌性大鼠为研究对象，探索MS180和MS15两种分离方法对雌性大鼠行为的影响，以及跑轮运动是否可以纠正母婴分离造成的雌性大鼠行为异常。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2只SPF级12周龄Sprague-Dawley（SD）孕鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司。采用Panlab Smart 3.0动物行为学视频分析系统，记录动物在旷场、十字高架、水迷宫3种行为学实验中的运动距离、运动时间等数据。所有大鼠在中国医科大学实验动物部饲养，实验期间均可以自由饮水、摄食，明暗周期为12 h/12 h（8：00～20：00），室温21～23 ℃，湿度50%～55%。筛选SD孕鼠分娩的雌性仔鼠22只作为研究对象。

1.2 实验分组以及造模方法

1.2.1 母婴分离造模：随机将仔鼠分为对照组（Control组）、MS15组和MS180组，在仔鼠出生后（postnatal day，PND）第2天（PND2）至第14天（PND14），将MS15组和MS180组的仔鼠从母鼠身边取出，放在单独的饲养笼内，每个饲养笼内放1只仔鼠，MS180或MS15后将仔鼠送回原母鼠所在的饲养笼继续喂养。Control组仔鼠不作任何处理，在母鼠所在饲养笼继续喂养。所有仔鼠均于PND21断奶，自由摄食、饮水，直至实验结束。

1.2.2 跑轮运动：PND21断奶分笼后，Control组、MS15组和MS180组均再细分为跑轮运动组（RW组）和非跑轮运动组（non-RW组），即对照非跑轮运动组（Control+non-RW组）、对照跑轮运动组（Control+RW组）、MS15非跑轮运动组（MS15+non-RW组）、MS15跑轮运动组（MS15+RW组）、MS180非跑轮运动组（MS180+non-RW组）、MS180跑轮运动 组（MS180+RW组）。PND22至PND35，Control+RW组、MS15+RW组、MS180+RW组的仔鼠每天进行不间断跑轮运动30 min。

1.2.3 旷场实验：所有仔鼠饲养至成年雌性大鼠后，即在PND63时，进行旷场、高架十字迷宫、水迷宫实验。将每只大鼠放在旷场（由40 cm高的黑色墙壁和100 cm×100 cm底座包围的黑色盒子）中央，自动分析系统记录行为5 min，观察大鼠在新环境中的自主行为、探究行为和紧张度。记录大鼠运动总距离、在中心区域的时间、进入中心区域的次数以及站立次数。

1.2.4 高架十字迷宫实验：十字高架主要观察动物的焦虑水平，开放臂的探索减少表明焦虑相关行为增强。该装置由2个开放臂（50 cm×10 cm）和2个与开放臂大小一致的闭合臂交叉组成，交叉形成一个中央区域（10 cm×10 cm），整个装置离地70 cm。将每只大鼠头朝向开放臂放置，在中央区域测试5 min，记录每只大鼠的运动总距离、进入开放臂和闭合臂的时间，以及进入闭合臂的次数。

1.2.5 水迷宫实验：水迷宫的圆形水箱被均等分为4个象限，一个直径为10 cm的圆形目标平台放置在第一象限。首先训练大鼠学习找到平台，训练5 d，训练时间内未找到平台的大鼠由实验员引导至平台上适应学习10 s。第6天撤走平台，让每只大鼠从距离平台最远的第三象限入水，测试时间为1 min，记录其跨越平台区域的次数、在第一象限停留的时间等指标，从而判断大鼠的认知学习记忆能力。

1.3 统计学分析

应用SPSS 23.0和Graphpad Prism8.0软件进行统计分析。计量资料用表示，多组间比较采用双因素方差分析，事后检验的两两比较采用Tukey法。服从正态分布的2个独立样本计量资料的比较采用独立样本t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验结果

采用双因素方差分析比较旷场实验中大鼠的运动总距离，结果发现，跑轮运动与母婴分离相互作用［F（2，16）=0.2661，P＞ 0.05］、跑轮运动因素［F（1，16）=0.1518，P＞ 0.05］对运动总距离无显著影响，母婴分离因素［F（2，16）=5.169，P＜ 0.05］对运动总距离有显著影响。采用Tukey法对Control、MS15和MS180三种母婴分离方法进行两两比较，结果发现，MS15组大鼠的运动总距离显著高于Control组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1A。

采用双因素方差分析比较旷场实验中大鼠进入中心区域的时间，结果发现，母婴分离因素和跑轮运动因素对大鼠进入中心区域的时间均无显著影响（P＞ 0.05）。见图1B。

采用双因素方差分析比较旷场实验中大鼠进入中心区域的次数，结果发现，跑轮运动与母婴分离相互作用［F（2，16）=2.592，P＞ 0.05］对进入中心区域的次数无显著影响，跑轮运动因素［F（1，16）=8.104，P＜ 0.05］、母婴分离因素［F（2，16）=22.43，P＜ 0.05］对进入中心区域的次数有显著影响。采用Tukey法对6组进行两两比较，结果发现，MS15+non-RW组大鼠进入中心区域的次数显著高于Control+non-RW组，MS180+RW组大鼠进入中心区域的次数显著高于MS180+non-RW组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1C。

采用两个独立样本t检验比较旷场实验中MS180+RW组和MS180+non-RW组大鼠站立次数，结果发现，MS180+RW组大鼠的站立次数显著高于MS180+non-RW组［分别为（19.75±2.754）和（13.25±4.5）次］，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1D。

图1 旷场实验统计结果Fig.1 Statistical results of the open-field test

2.2 十字高架实验结果

采用双因素方差分析比较十字高架实验中大鼠的运动总距离和进入开放臂的时间，结果发现，母婴分离因素和跑轮运动因素对大鼠的运动总距离以及进入开放臂的时间均无显著影响（P＞0.05）。见图2A、2B。

采用两个独立样本t检验比较十字高架实验中MS180+RW组和MS180+non-RW组大鼠进入闭合臂的时间，结果发现，MS180+non-RW组大鼠进入闭合臂的时间显著高于MS180+RW组［分别为（189.935±43.127）和（114.515±35.293）s］，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图2C。

采用双因素方差分析比较十字高架实验中大鼠进入闭合臂的次数，结果发现，母婴分离因素和跑轮运动因素对大鼠进入闭合臂的次数均无显著影响（P＞ 0.05）。见图2D。

图2 十字高架实验统计结果Fig.2 Statistical results of the elevated plus-maze test

2.3 水迷宫结果

采用重复测量方法分析比较各组大鼠在训练5 d内找到目标平台所需时间的变化。结果发现，训练天数因素［F（2.970，47.53）=16.11，P＜ 0.05］对所有大鼠找到目标平台所需的时间有显著影响，即所有大鼠找到目标平台所需的时间随训练天数的增多而减少，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；但组别因素［F（5，16）=1.824，P＞ 0.05］对大鼠找到目标平台所需的时间无显著影响，即6组间大鼠找到目标平台所需的时间无显著差异（P＞ 0.05）。见图3A。

采用双因素方差分析比较大鼠在水迷宫实验中进入第一象限的次数、在第一象限停留的时间和大鼠跨越目标平台的次数，结果发现，母婴分离因素和跑轮运动因素对以上3个测试指标均无显著影响（P＞ 0.05）。见图3B～3D。

图3 水迷宫实验统计结果Fig.3 Statistical results of the water maze test

3 讨论

3.1 母婴分离造成雌性大鼠成年后行为异常

研究［9］发现，母婴分离可提高大鼠的焦虑样水平、增加大鼠的抑郁样行为，损害大鼠的认知功能。同时，蔗糖偏好研究［10］结果显示，母婴分离导致大鼠的快感缺乏。此外，不同的母婴分离方法造成的影响不同。有综述［11］报道，MS15能够增强大鼠对压力的应对能力，因为MS15模型模仿了自然界大鼠离开幼崽在短时间内收集食物的过程，是一种自然事件，因此MS15能够减少仔鼠的焦虑样行为。本研究发现，在旷场实验中，MS15+non-RW组大鼠进入中心次数比Control+non-RW组明显增多，提示MS15大鼠对新环境的探索欲望更强烈，焦虑恐惧水平更低。因此，MS15这种短期的母婴分离会对雌性大鼠起到积极的作用。但是，MS180组大鼠与Control组大鼠相比，未见显著行为差异。同时，水迷宫实验未发现母婴分离造成的记忆认知障碍这一行为异常表现，其原因需要更多的实验验证。

3.2 跑轮运动对MS180雌性大鼠抑郁行为的治疗效果显著

研究［12］发现，运动可以缓解母婴分离造成行为异常表现，跑轮运动可以减轻母婴分离对大鼠的负性影响，大鼠在青春期的跑轮运动增加了母婴分离大鼠的蔗糖偏好，有效逆转了在喷溅实验中母婴分离导致的对自我照顾的负性影响，说明跑轮运动能够诱发母婴分离大鼠的抗抑郁作用。本研究发现，跑轮运动的改善作用在MS180大鼠中最为明显。在旷场实验中MS180+RW组大鼠进入中心的次数显著高于MS180+non-RW组，这表明经过跑轮运动的MS180大鼠明显增加了对新环境的探索欲望。同时，十字高架实验发现，MS180+non-RW组大鼠进入闭合臂的时间显著高于MS180+RW组，提示经过跑轮运动后的MS180大鼠焦虑水平明显降低。这些结果表明，跑轮运动对MS180的治疗有效。而跑轮运动造成的影响在Control大鼠和MS15大鼠中并未发现，说明运动对MS180这样的较长时间母婴分离的治疗效果更显著。

综上所述，本研究表明，MS15对雌性大鼠起积极作用，可以降低雌性大鼠的焦虑水平，提高雌性大鼠对新环境的探索欲望，跑轮运动对MS180的治疗效果显著。本研究的局限性在于只对母婴分离造成的雌性大鼠异常行为进行了研究，对于造成这些异常行为的神经生物学改变还需要进行进一步研究。