非洲猪瘟病毒检测技术概述

张皖静,张 琪,张晓霞,吴文静,杨 丹,袁文天,许 燕*,赵 凯

(1 上海师范大学生命科学学院,上海 200234;2 上海博满生物科技有限公司,上海 201106;3上海市农业科学院生物技术研究所,上海 201106 )

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)被我国列为A 类重点防范传染病。 起初,非洲猪瘟发生在非洲国家肯尼亚,因此命名为非洲猪瘟,并传播到西欧国家。 2017 年3 月,在俄罗斯远东地区发现了非洲猪瘟;2018 年8 月3 日,中国确诊首个非洲猪瘟病例。 非洲猪瘟可以通过血液、粪便、分泌物、尿液、泪液、伤口和空气传播,呈流行性发生时,病毒迅速蔓延。 病猪的临床表现是体温迅速升高、呼吸急促、呼吸困难、呕吐、死亡等症状。 我国是生猪和猪肉的主要生产和消费国,由于尚未研制出预防非洲猪瘟的有效疫苗,非洲猪瘟病毒的检测技术研究迫在眉睫。

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)属于DNA 病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属成员,也是这个家族唯一的成员。 非洲猪瘟病毒是一条双链DNA 分子,基因组全长约为170—190 kb,含有151 个开放阅读框(ORFs),以非洲猪瘟病毒为模板,可以编码150—200 种蛋白,如p72 蛋白。 其中p72蛋白是最重要的结构蛋白之一,在非洲猪瘟病毒检测中经常用作非洲猪瘟的血清学诊断。 欧洲毒株基因(即格鲁吉亚2007∕1 株)与报道的中国辽宁省沈阳市沈北新区某养殖场发生的非洲猪瘟病毒序列完全匹配,可以此为靶序列构建非洲猪瘟病毒质粒作为核酸检测的阳性对照。 目前非洲猪瘟病毒的检测主要分为免疫学检测方法和核酸检测方法。

1 免疫学检测方法

1.1 ELISA 检测(酶联免疫吸附试验)

酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理是将特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合起来,该方法在检测抗体和抗原方面发挥着重要的作用。 应用ELISA 法检测非洲猪瘟病毒,可以在早期检测出带有非洲猪瘟的病猪,并及时予以隔离。 ELISA 法具有高灵敏度、可以大量检测的优点,但也存在特异性不强、每个试剂盒的标准不均一的局限性。 2012 年,董志珍等[1]将克隆获得的ASFV 蛋白对小鼠进行免疫获得单克隆抗体,利用此单克隆抗体建立了非洲猪瘟抗体的ELISA 检测法,这种方法具有很强的特异性,比间接荧光法的灵敏度更高。 2016 年,曹琛福等[2]利用大肠杆菌转化表达获得了P54 蛋白,从而建立了非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA 方法,这种方法通过特异性检测,与其他病毒均无交叉反应,特异性达100%,灵敏度达96.22%。

1.2 胶体金免疫层析(GICA)试纸条

胶体金是一种常见的标记技术。 它是一种以胶体金为示踪剂标记的用于抗原抗体的免疫标记技术,具有独特的优势。 非洲猪瘟抗原涂在硝酸纤维素膜的检测区域,将有胶体金标记的非洲猪瘟抗原附着于下部,形成免疫金标试纸条。 使用该试纸条建立用于检测非洲猪瘟抗体水平的免疫金标记方法,优点在于试纸条不仅可以用于血清的检测,也可以用于检测全血样品,操作简便快速,结果准确率高、肉眼可直接判断,适用于抗体检测和现场样本的大规模推广;缺点在于需要获得非洲猪瘟的抗原,但非洲猪瘟病毒变异性强,获得有效的抗原有一定的难度。 2017 年,林彦星等[3]为了筛选出具有抗原性的非洲猪瘟病毒蛋白多肽,将牛血清蛋白(BSA)与利用非洲猪瘟病毒的VP73 蛋白合成的多肽进行偶联,从而建立了非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析检测技术。 这种技术具有较强的特异性和稳定性,但不足之处在于灵敏度低,检测结果需要根据临床性状和病史判断,并且只能对死猪检测,试验结果还需要核酸检测验证。

2 分子生物学检测方法

2.1 PCR 技术(聚合酶链式扩增)

PCR 技术是一种用于扩增特定DNA 片段的分子生物学技术。 模板可以是DNA 或者RNA,当模板是DNA 时,DNA 聚合酶从一小段双链DNA 开始合成,互补序列与1 个或2 个合成寡核苷酸引物的单链DNA模板结合,一部分形成双链结构。 基于PCR 的PCR 仪器实际上是一种温度控制装置,可以在变性温度、复性温度和延伸温度之间进行控制。 用这种方法检测非洲猪瘟病毒存在与否,优点在于方法简单,不易污染,但也存在操作时间长,检测一组非洲猪瘟病毒时间为2—3 h,且灵敏度较低,若模板拷贝数较低可能无法检测出等缺点。 非洲猪瘟病毒中的B646L基因具有一段保守区,因此常常被用来设计引物检测非洲猪瘟病毒的存在。 Basto 等[4]基于B646L基因设计了一对引物,以建立具有内部引物扩增片段243 bp和外部引物扩增片段370 bp 的ASFV 巢式PCR 方法。 该方法不仅可以检测组织、血液样本和培养物,还可以检测携带ASFV 的昆虫。 2008 年,Giammarioli 等[5]建立了多重PCR 方法用来检测ASFV、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2 型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪繁殖与呼吸障碍综合病(PRRS),其中,对ASFV 检测使用的引物就是使用世界动物卫生组织(OIE)推荐的保守区设计的引物。 但是,由于PCR 需要分析扩增产物,极微量的PCR 产物交叉污染可能导致假阳性;临床上还可能存在酶抑制剂导致产物无法进行扩增,从而导致假阴性。

2.2 Real-time PCR 技术(实时荧光定量PCR)

实时荧光定量PCR(Real-Time Flurescent Quantitive Polymerase Chain Reaction)是运用具有特异性的荧光探针技术,将试验操作时间控制在数小时内。 设计多对引物,并且同时进行多组荧光定量PCR,可以用来检测非洲猪瘟病毒是否存在、及其病毒含量,其优点在于可将结果量化,通过明确的数据显示结果,具有引物和探针的双重特异性,因此实时荧光定量PCR 具有很强的特异性。 利用SYBR Green1 作为荧光染料即采用完全闭管式操作,避免了产物产生阳性污染,同时提高了检测速度。 但是用这种方法测定非洲猪瘟病毒的存在,只能够单管单测,且操作步骤复杂繁琐,需要专业人员操作及专业实验室。 董志珍等[6]设计出基于E183L基因的引物和探针,并建立了ASFV 荧光定量PCR 方法,这种方法可检测小于15 copies∕μL 的病毒样品,并获得了国家专利。 根据OIE 推荐的保守区,King 等[7]建立了非洲猪瘟的TaqMan 探针荧光PCR 检测方法,使用的荧光探针和引物均由B646L的高度保守区设计,灵敏度提高了10—100 倍。

2.3 重组酶聚合酶扩增(RPA)技术

RPA 技术是一种新兴的可以在常温下进行的核酸快速扩增技术,它模拟了DNA 在细胞中的扩增方式,在常温且等温的条件下,引物与重组酶形成聚合体,这种聚合体能够促进引物与模板配对,单链DNA结合蛋白(SSB)能够促进模板DNA 解旋,然后在DNA 聚合酶的作用下形成新的DNA 互补链。 其反应速度快,产物DNA 数量呈指数增加,一般反应时间小于10 min。 2016 年,王建昌等[8]建立了非洲猪瘟病毒的RPA 检测方法,根据已知的非洲猪瘟病毒中P72 的保守区设计引物,设计出该病毒的RPA 检测方法,通过这种方法,非洲猪瘟最低检测到100 copies∕μL。 2017 年,李林等[9]对非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守区设计引物,从而建立了非洲猪瘟病毒的RPA 检测方法,该方法对非洲猪瘟病毒的检测时间小于20 min,最低检测限为16 copies∕μL,具有较高的灵敏度和较强的特异性;缺点是试剂成本较高。

2.4 LAMP 技术(环介导等温扩增技术)

环介导等温扩增核酸技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新兴的核酸检测技术。 2009 年,江彦增等[10]根据OIE 推荐的引物,建立了非洲猪瘟的LAMP 检测方法,相比于OIE 的推荐的PCR 方法,此方法的灵敏度提高了100 倍。 本研究课题组利用非洲猪瘟病毒中P72 的保守区设计了3对引物,建立了非洲猪瘟病毒LAMP 检测方法。 试验结果用荧光进行显色判断,阳性产物为绿色,阴性产物为橘红色,无需电泳即可进行可视化判断。 这三对引物其中一对为环引物,用于识别目标序列中识别位置的特定扩展序列,这大大提高了核酸扩增的特异性,加快了反应速度。 LAMP 反应发生在恒温条件下,只需要金属浴、3 把移液器即可操作,设备简单,总费用6 000 元(人民币,下同);试剂成本低,一头生猪试剂成本只需2 元。 根据对非洲猪瘟病毒的临床检测,LAMP 反应检测灵敏度为2 copies∕μL,检测时间为20 min。 具有高灵敏度,反应时间短,温度要求低的优点。 在百级净化车间,将试剂分装为两部分,A 试剂吹干在管盖上,B 试剂分装在PCR 管中,封装好。 现场只需加样一次,减化了操作步骤,减少了劳动强度和受污染的风险。 由于核酸染料在反应前体系配制时加入,反应后无需开盖添加染料进行显色,避免了开盖产生的气溶胶的污染。 试剂放置室温可长达7 个月,避免了冷链运输。 液体样品可以直接加入反应体系作为模板,无需进行纯化,固体样品加入裂解液,95 ℃裂解10 min,上清液即可作为模板。 现场操作步骤简单易学。 然而,LAMP 检测方法也具有一定的局限性:靶序列要求较长,低于100 bp 无法设计引物。

3 展望

目前,全球尚无有效的非洲猪瘟疫苗可用于预防,有效的防控仍是对非洲猪瘟病毒进行检测,落实及时发现、快速处置、精准管控。 根据检测结果,对发生疫情的地方严防死守,对疫点地区生猪全部扑杀,进行无害化处理,防止疫情的扩散。 农业农村部要求生猪养殖、饲料厂、屠宰厂和流通环节必须严格进行非洲猪瘟病毒检测。

现在非洲猪瘟病毒的检测技术主要分为定量和定性两个方面。 其中,定量主要是实时荧光定量PCR技术。 这种方法的优点在于特异性强,灵敏度较高,可以对试验结果进行量化分析;缺点在于仪器设备成本高,需要专业人员进行操作,操作时间长,同时需要配备专业的实验室,不适合现场检测。 定性主要有ELISA、胶体金免疫层析试纸条、RPA 技术和LAMP 技术。 ELISA 的优点在于通量高,缺点在于灵敏度低,需要专业的实验室和专业人员操作。 胶体金免疫层析试纸条优点在于可用于现场可视化检测,操作方便;缺点在于灵敏度低,检测结果需要根据临床性状和病史判断,并且只能对死猪检测,结果还需要核酸检测验证。 RPA 的优点在于灵敏度高,反应时间短,操作方便,可用于现场可视化检测;缺点是试剂成本高。 LAMP 优点特异性强,灵敏度高,反应时间短,可用于现场可视化检测,操作方便,试剂成本低;缺点是RPA 和LAMP 灵敏度非常高,容易污染,现场采取无污染操作措施要求高。

根据目前非洲猪瘟流行情况,现场检测要求通量大和快速简便,有时需要对结果定量分析,因此检测方法应向兼顾定性定量、高通量方向发展。 另外,样品制备、样本的处理、核酸扩增和结果的显示,应向自动化、一体化方向发展。