纤维蛋白原的临床检测与应用

马丽云

（北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，北京 102206）

纤维蛋白原是一种分子量约为340,000 道尔顿的糖蛋白，在正常血浆中的浓度范围是2～4g/L (200～400mg/dL)。它在肝脏中合成(1.7～5g/天)。纤维蛋白原的合成受编码β 链合成的基因控制。由于该基因的遗传多态性，血浆中的纤维蛋白原水平存在个体差异。纤维蛋白原的半衰期约为3～5 天。纤维蛋白原由6 条链组成：2Aα，2Bβ 和2γ。凝血酶(因子Ⅱa)将纤维蛋白原分子裂解成两个纤维蛋白肽A(FPA)片段(从Aα 链)和两个纤维蛋白肽B(FPB)片段(从Bβ 链)。由此产生的纤维蛋白单体聚合形成纤维蛋白，随后在因子XIIIa 的作用下成为稳定的结构。过程首先是两个纤维蛋白单体的两条γ 链结合。结合后的纤维蛋白是为D-二聚体(D-Dimer)的来源，D-Dimer 是纤维蛋白的特定降解产物。

纤维蛋白原含量增高见于糖尿病、急性心肌梗死、急性传染病、结缔组织病、急性肾炎、多发性骨髓瘤、休克、大手术后、妊高征、急性感染、恶性肿瘤和应急状态等。降低常见于先天性低或无FIB 血症、遗传性FIB异常、DIC、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。此外，纤维蛋白原还可能是心血管血栓性疾病的致病因素。因此纤维蛋白原的测定在临床诊断上有很重要的临床意义。

纤维蛋白原检测试剂盒根据检测原理可分为凝固法、免疫比浊法、磁珠搅拌法、Clauss 法等。

其中凝固法的检测原理是在过量的凝血酶存在下，稀释血浆的凝固时间可直接反映血浆中纤维蛋白原的水平；免疫比浊法：标本中的FDP 与鼠抗FDP 单克隆抗体胶乳粒发生抗原抗体反应，产生凝聚导致浊度上升。通过分光光度计测定浊度变化率，求出FDP 的浓度。磁珠搅拌法：凝血酶是一种活力强大的，可做用于多种凝血因子的水解酶，其首要功能是使FIB分解生成FM 和两个小肽碎片（A 肽和B 肽），A 肽和B 肽在FX Ⅲ及Ca2+作用下可以使一个分子的ε-赖氨酰基作为供体，以另外一个单体分子γ-谷氨酰基作为受体进行共价交联，形成稳定的纤维蛋白，生成的纤维蛋白所用的时间与纤维蛋白原的含量成反比，通过光电子法测定杯内钢球震幅的改变来测定凝固时间。Clauss 法：凝血酶可以将可溶性血浆纤维蛋白原转变成不溶性的多倍体纤维素，在高浓度凝血酶和低浓度纤维蛋白原的条件下，血浆凝固时间由纤维日蛋白原的浓度决定，在双对数坐标纸上作图，凝血酶凝固时间与纤维蛋白原的浓度呈反比的线性关系。

目前体外诊断试剂的市场上有很多关于纤维蛋白原测定的试剂盒。例如：纤维蛋白原测定试剂盒（凝固法）、纤维蛋白原测定试剂盒（免疫比浊法）、纤维蛋白原测定试剂盒（磁珠搅拌法）、纤维蛋白原测定试剂盒（Clauss 法）等。但是试剂盒之间也会存在技术差异，因此为了更好地判定试剂盒的检测能力，以及检测结果与临床诊断的相关程度。选取任意两个已上市销售的纤维蛋白原测定试剂盒（凝固法）（以下简称试剂A）、纤维蛋白原测定试剂盒（免疫比浊法）（以下简称试剂B）/纤维蛋白原测定试剂盒（磁珠搅拌法）（以下简称试剂C）做了以下研究。

选取医院科室日常检验剩余枸橼酸钠血浆110 例，包括检测水平正常及异常的样本。样本的处理方法为：采集9 份体积的血液于1 份体积0.109M(即浓度3.2%)的枸橼酸钠抗凝剂中。2,000-2,500g 离心15 分钟。于20±5℃下保存不超过8 小时。选取的样本要求：临床剩余样本；非严重溶血、混浊的样本；未被微生物污染的样本；样本采集和处理符合标准实验室处理要求的样本。数据处理的要求：统计时剔除超出线性的检测样本。样本编盲要求：由非盲态研究者负责收集样本，并将样本去标识化、符合要求的样本应在检测前进行编号，样本编号的原则建议根据样本纳入的先后顺序，给予一个4 位数的样本号（按照入组顺序为001,002,003 等），如1001,1002 等。并保留样本原始编号和新编号的对应关系，以便试验数据的核查，编号完毕再由一位盲态研究者进行测试。

在测定过程中，对样本分别用受试试剂和对比试剂进行测定，分别记录测量值，并对数据进行如下分析。定量分析：根据试剂A 的测定结果与试剂B 的测定结果，求出线性回归方程，计算样本浓度范围、相关系数（r）及常数的95%置信区间。定性分析：根据试剂A及试剂B说明书的各自规定，检测结果在各自参考值范围内的，判断为阴性；检测结果在各自参考值范围外的，判断为阳性。如试剂A 和试剂B 的定性分析不符，则用试剂C 作为第三方检测结果进行检测并判定。以试剂B 检出结果作为参照，计算试剂A 的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率和研究试剂和对比试剂的一致性kappa值。阳性符合率：受试试剂阳性样本占对比试剂阳性样本的比例。阴性符合率：受试试剂阴性样本占对比试剂阴性样本的比例。总体符合率：检出结果一致的样本占总样本的比例。kappa 值：受试试剂和对比试剂的一致性。

本次入组的样本临床诊断多为糖尿病、急性心肌梗死、急性传染病、结缔组织病、急性肾炎、多发性骨髓瘤、休克、大手术后、妊高征、急性感染、恶性肿瘤和应急状态DIC、原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。根据此次试剂A 和试剂B 对入组的110 例样本的检测，其中1 例样本对试剂A 和试剂B 均超出检测上限，所以在最终统计中需剔除此样本的检测结果。因此最终对109 例样本的检测结果进行定量及定性的数据统计分析。统计结果如下。

定量统计结果分析：样本数量109例，Y截距0.0307，相关系数0.9913，斜率0.9481，样本浓度范围1.55g/L-7.51g/L。设试剂B 测定结果为X，试剂A 测定结果为Y，经计算，N=109 次，r=0.9913，P=0.000（P〈0.001），根据统计学原理，两组数据高度相关。一元线性回归方程为：y=0.9481x +0.0307。对试剂A 和试剂B 的测定值的进行线性回归分析样本浓度范围为1.55g/L-7.51g/L，试剂A 和试剂B 的测定值的Pearson 相关系数（r）为0.9913，P〈0.001。以受试产品测定值为Y 变量，对比产品测定值为X 变量拟合线性回归方程，y=0.9481x+0.0307，其回归系数为0.9481，回归系数的95%可信区间为0.919-0.967，常数的95%可信区间为-0.082 -0.130，线性回归方程具有统计学意义（F 值=6095.451，P〈0.001），说明受试产品和对比产品检测结果相关性良好。

定性统计结果分析：根据试剂A 及试剂B 说明书的各自规定，试剂A检测结果2g/L-4g/L 为阴性，其余检测结果为阳性。试剂B 检测结果2g/L-4g/L 的为阴性，其余检测结果为阳性。试剂C 检测结果2g/L-4g/L 为阴性，其余检测结果为阳性。本次试验共检测110 例样本，对这110 例有效样本进行定性分析（其中在定量分析时，剔除的5 号样本（原因：试剂A和试剂B 检测结果均超出线性上限），有定性意义，故在本次定性分析时无需剔除）结果如下。以试剂B 检出结果作为参照，计算试剂A 的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率和试剂A 和试剂B 的一致性kappa 值。阳性符合率＝(3+42)/(4+48)×100%＝86.54%，阴性符合率＝54/58×100%＝93.10%，总符合率＝(3+42+54)/110×100%＝90.00%，Kappa 值＝0.799。

不符样本结果如下描述：样本1：性别女，年龄33 岁，临床诊断为乏力，脑血管病（慢性病），缺血性脑卒中恢复期，慢性胃炎，试剂A检测结果4.02g/L，试剂B 检测结果3.92 g/L，试剂C 检测结果4.05 g/L；样本2：性别男，年龄53 岁，脑血管病（慢性病），高脂血症，试剂A 检测结果2.03g/L，试剂B 检测结果1.90 g/L，试剂C 检测结果2.20g/L；样本3：性别女，年龄64 岁，高脂血症，动脉硬化，脑血管病（慢性病），静脉曲张，上感，试剂A检测结果3.94g/L，试剂B检测结果4.18g/L，试剂C检测结果3.95g/L；样本4：性别女，年龄41 岁，呼吸道感染，感冒，支气管炎，试剂A 检测结果3.70g/L，试剂B 检测结果4.21g/L，试剂C 检测结果4.55g/L；样本5：性别女，年龄26 岁，急性播散性脑脊髓炎，肺部感染，血小板减少症，高血压（慢性病），试剂A 检测结果3.91g/L，试剂B 检测结果4.11g/L，试剂C 检测结果4.47g/L；样本6：性别女，年龄79 岁，腰椎间盘突出，腰椎管狭窄，腰痛，腰椎间盘突出，试剂A 检测结果3.66g/L，试剂B 检测结果4.28 g/L，试剂C 检测结果3.98g/L；样本7：性别男，年龄82 岁，脑血管病（慢性病），尿失禁，试剂A检测结果4.10g/L，试剂B检测结果3.98g/L，试剂C 检测结果4.47g/L；样本8：性别男，年龄29 岁，脑血管病（慢性病），急性脑梗死（左顶叶皮层及岛叶），颈动脉狭窄，试剂A 检测结果1.83g/L，试剂B 检测结果2.02g/L，试剂C 检测结果2.44g/L；样本9：性别男，年龄77 岁，糖尿病（慢性病），高血压（慢性病），冠心病（慢性病），脑血管病，试剂A 检测结果1.79 g/L，试剂B 检测结果2.13g/L，试剂C 检测结果2.07g/L；样本10：性别男，年龄63 岁，冠心病（慢性病），冠心病（慢性病），糖尿病（慢性病），试剂A检测结果3.87g/L，试剂B检测结果4.21g/L，试剂C 检测结果3.95g/L；样本11：性别男，年龄65 岁，脑血管病（慢性病），动脉粥样硬化，高脂血症，周围神经病，试剂A 检测结果3.76g/L，试剂B 检测结果4.18g/L，试剂C 检测结果3.40g/L。

分析：本次临床试验不符的样本共11 例，其中：4 例样本试剂B 检测结果在参考值范围内，但试剂A 检测结果在参考值范围外；7 例样本试剂B 检测结果在参考值范围外，但试剂A 检测结果在参考值范围内；结合试剂C 的检测结果分析：11 例不符的样本中，有7 例样本试剂A 检测结果与试剂C 的检测结果相符；4 例样本试剂B 检测结果与试剂C 的检测结果相符。从测值来看，试剂A 与试剂B 两组测值相近。且试剂A、试剂B、试剂C 的检测结果三组测值相近。其中不符的测值都在参考值附近，不符的原因很可能是因为系统之间的差异造成，另外部分疾病本身对于测值也有一定影响，所以三种测值有可能会存在一定差异。但是这种差异对于临床诊断的判别影响不大，因为临床医生不会仅仅根据临床的检测结果进行病人诊断，病人诊断的确定是根据病人针对性的检查与临床观察和病人描述等多种因素综合诊断得出。

根据此次任意选取的三种已上市的常见的纤维蛋白原检测试剂盒作为检测试剂，对110 例样本同时进行试验分析得出，不同的试剂盒对于同一份样本的检测结果之间存在差异，但此差异的出现可能是因为检测系统及样本本身造成的，此类情况在临床上是可以接受的。