黄晶果采后主要病原菌的分离与鉴定

徐丹丹，乔 方,*，刘 敏，林泽勉，禤文生

（1. 深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，深圳职业技术学院博士后创新实践基地，广东 深圳 518055；2. 深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳 518005；3. 华南农业大学植物保护学院，广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642；4. 广东龙飞生物有限公司，广东 江门 529200）

黄晶果（Pouteria caimito Radlk.）又名亚美果、雅美果，属山榄科（Sapotaceae）多年生常绿乔木，其成熟果实果型饱满，果皮金黄色，呈革质，果肉为奶油白色、半透明状、似果冻，口感清甜多汁，入口有清凉感，有胶质黏液[1]。该水果原产于亚马逊上游，目前广泛分布于拉丁美洲、澳大利亚和东南亚等地区，20 世纪90年代黄晶果作为一种新兴水果被引进我国，因其不仅能鲜食，还兼具一定药用功效，营养价值丰富，深受消费者的喜爱，未来市场前景广阔、消费潜力巨大[2]。但是，采后的黄晶果因含水量和含糖量高，生长代谢旺盛，极易遭受病原菌的侵染，其引发的褐变腐烂极大地影响了果实的商品价值，成为阻碍黄晶果产业发展的主要原因之一。

国内外对黄晶果的研究较少，仅有少数文章报道其引种特性的相关研究，尚无研究关注该水果的采后病害。本研究采用传统组织分离法对黄晶果采后常温贮藏过程中的病原菌进行分离纯化，并结合形态学特征和ITS、TUB2 序列对分离纯化的病原菌进行分析，旨在明确引起黄晶果采后病害的病原微生物种类，以期为黄晶果采后病害的生物防控及延长其采后贮藏期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

于2020 年8 月15 日，在广东台山龙飞生物有限公司黄晶果种植基地采集黄晶果果实（品种“白绵绵”），挑选成熟度一致（8～9 成熟）且健康无病的果实，于室温下放置，待果实发病后分离病原菌进行后续试验研究。

真菌基因组DNA 提取试剂盒，购自Omega 生物工程有限公司；琼脂糖、2×MasterMix 等分子试剂，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；琼脂粉、葡萄糖，购自北京鼎国生物技术有限公司；其他生化试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

MJ-Ⅱ霉菌培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD 超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HV-50 高压灭菌锅，日本Hirayama 公司；Gel Dox XR+凝胶成像系统、T100PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；BX53 光学显微镜，日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

取黄晶果果实发病部位病健交界处的组织，于75%的酒精中浸泡10 s，迅速用无菌滤纸吸出酒精后，移入2%的次氯酸钠溶液中浸泡1～2 min，而后用无菌水冲洗3 次，用无菌滤纸吸干组织块，移入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基）中，25 ℃培养3～5 d。待组织块边缘长出新鲜菌落，用无菌接种针挑取菌丝尖端进行纯化培养。

1.2.2 致病性测定

将分离纯化后的菌株在PDA 培养基上培养5～7 d后，用打孔器打取直径为5 mm 的菌饼。选取健康的黄晶果果实，用75%的酒精对黄晶果进行表面消毒后再用无菌水冲洗、晾干。采用针刺法接种，即随机选取6 个果实，用无菌接种针在每个果实上刺破4 个孔，孔径约为1 mm，其中3 个果实的伤口处接种含有菌丝的菌饼，另外3 个果实的伤口仅接种无菌PDA菌饼作为对照。然后将所有处理过的果实置于接种盒内，于25 ℃下培养，定期记录果实的发病情况。待果实发病后进行病原菌分离。

1.2.3 形态学鉴定

将纯化后菌株接种于PDA 培养基上，于25 ℃下恒温培养，拍照观察菌落形态，待菌产孢后利用光学显微镜记录孢子形态和结构，并测量孢子大小。

1.2.4 DNA 提取与基因序列扩增

将分离纯化的病原菌于PDA 培养基上培养5～7 d，刮取菌丝于液氮下研磨均匀，选用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。选用真菌内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCT CCGCTTATTGATAT GC-3’）和β-微管蛋白基因（β-Tubulin，TUB2）引 物Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGG TGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGT GAC CCTTGGC-3’）进行PCR扩增。PCR 反应体系总体积为25 μL，DNA 模板1 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），2×MasterMix 12.5 μL，加ddH2O 补足至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸7 min。

取5 μL PCR 扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将PCR 产物送至北京六合华大基因科技有限公司广州分公司测序。将测得的基因序列与GenBank 中的序列进行BLAST 比对，下载同源性高的已知序列，使用MEGA6.0 软件以最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统进化树，以自展法（Bootstrap）进行检测，共循环1 000 次。

2 结果与分析

2.1 黄晶果果实贮藏期的发病症状和病原菌致病性测定

综合分析黄晶果贮藏过程中表现出的病害症状，主要有以下几种：病症a，果实初期果皮变褐，之后迅速滋生白色霉层，霉层下有液滴浸出，后期果肉迅速软腐（图1 A1）；病症b，果实发病初期在果蒂处出现褐色轮纹状晕圈，后期晕圈联合成褐色病斑（图1 B1）；病症c，发病初期在果实果蒂处现褐色坏死状病斑，后期病斑扩展导致果实腐烂（图1 C1）；病症d，在果实表面呈现凹陷坏死状圆斑（图1 D1）；病症e，在果实表面呈现为不规则圆形褐色病斑（图1 E1）。

依据柯赫氏法则，分别从具有病症a、b、c、d、e 的果实组织中分离纯化得到病原菌疑似菌株A、B、C、D、E。将得到的5 株菌株回接至健康的黄晶果果实上，依据发病症状判断该菌株是否为果实致病菌，结果表明：5 株病原菌疑似菌株接种至黄晶果果实均能引起果实发病，并呈现与自然发病类似的病症（图1 A2～E2）。进行再分离后，均能从发病部位分离得到与接种菌相同的菌株，回接后再分离率均为100%。

图1 黄晶果果实的5 种发病症状及病原菌回接发病症状Fig.1 Symptoms of infected and reinoculated with five strains on abiu

2.2 黄晶果果实病原菌菌落形态特征

黄晶果病症a 的病原菌A（图2 A1、A2）生长迅速，气生菌丝发达，3 d 后，在PDA 培养基上的菌落直径即达到90 mm，菌落初期白色，渐变为浅灰褐色、鼠灰色至黑色，绒毛状，菌落反面暗黑色至黑色；病症b的病原菌B（图2 B1、B2） 在PDA 培养基上培养6 d后，菌落呈近圆形，菌落正面呈白色花瓣式轮纹状，菌落背面呈黄白色，在接种菌饼处可见油状黑色黏液，为病原菌的分生孢子；病症c 的病原菌C（图2 C1、C2）于PDA 培养基上培养6 d 后，菌落呈白色，平整，边缘不规则，菌落中央有黑褐色的小点，为病原菌的分生孢子器；病症d 的病原菌D（图2 D1、D2）在PDA培养基上，菌丝呈白色绒状，后期菌落颜色变为橘红色，为病原菌产生的色素；病症e 的病原菌E（图2 E1、E2）的孢子易飞散，在同一PDA 培养基上形成多个菌落，其菌落生长快，初期为白色，2～3 d 后转为棕黑色，呈粉末状。

图2 黄晶果果实5 种病原菌的菌落形态Fig.2 Colony characteristics of five strains on PDA medium

2.3 黄晶果果实病原菌的显微形态特征

由图3 可见，各菌株在PDA 培养基上25 ℃培养不同时间段后，显微形态各异。菌株A（图3 A1、A2）在PDA 培养基上培养60 d 后可产生分生孢子，分生孢子椭圆形或卵形，初期单胞无色，老熟后呈褐色，近中部有一个横隔膜，其大小为（20.73～26.16）μm×（11.94～13.93）μm；菌株B（图3 B1、B2）在PDA 培养基上培养7 d 后可产生分生孢子，分生孢子呈纺锤状，有5 个细胞，中间3 个细胞呈褐色，顶部细胞无色，有2～3 根顶部附属丝，尾部细胞无色，有1 根中生式尾毛，其大小为（16.15～23.86）μm×（6.05～8.16）μm；菌株C（图3 C1、C2）在PDA 培养基上培养60 d 后可产生β 型分生孢子，未见α 型分生孢子，β 型分生孢子无色、单胞、线形、一端常为钩状，大小为（24.54～31.37）μm×（1.30～1.84）μm；菌株D（图3 D1、D2）在PDA 培养基上培养7 d 后可产生分生孢子，其大型分生孢子呈镰刀型，多细胞无色，一般有3～5 个隔膜，大小为（7.48～11.65）μm×（2.73～4.27）μm，小型分生孢子呈椭圆形或卵形，有0～1 个隔膜，大小为（3.79～6.49）μm×（1.93～2.75）μm；菌株E（图3 E1～E3）在PDA 培养基上培养3 d 后即可产生大量分生孢子，分生孢子呈圆球形，表面粗糙有小刺，可粘附于分生孢子梗上，分生孢子大小为3.52～4.37 μm。

图3 黄晶果果实5 种病原菌的显微形态观察Fig.3 Morphological characteristics of five strains from abiu

对上述5 株真菌的菌落形态和显微形态的特征进行综合分析，菌株A 与毛色二孢属（Lasiodiplodia）真菌形态一致[3]，菌株B 与拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）真菌形态一致[4]，菌株C 与间座壳属（Diaporthe）真菌形态一致[5]，菌株D 与镰孢菌属（Fusarium）真菌形态一致[6]，菌株E 与曲霉属（Aspergillus）真菌形态一致[7]。

2.4 联合基因系统进化树分析

将从黄晶果果实分离得到的5 株致病型病原菌的ITS 区域序列和TUB2 基因序列进行Blast 比对，于GeneBank 数据库中搜索同源序列构建系统进化树，结果见图4。从图4 可以看出，5 株病原菌分别属于5 个不同的属，由系统发育树可看出，菌株A、B、C、D、E 分别与可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、蔷薇拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis rosae）、间座壳真菌（Diaporthe pseudomangiferae）、层出镰孢菌（Fusarium proliferatum） 和棘孢曲霉（Aspergillus aculeatinus）聚在一起，各自形成明显的分支，且每个分支间有很高的支持率，结合各菌株的孢子形态特征，将菌株A、B、C、D 和E 分别鉴定为可可毛色二孢、蔷薇拟盘多毛孢、间座壳真菌、层出镰孢菌和棘孢曲霉。

图4 基于最大似然法构建的联合基因（ITS 和TUB2）系统进化树鉴定各病原菌Fig.4 Phylogenetic tree generated by maximum likelihood analysis based on alignment of ITS and TUB2 gene sequences for identification of all tested pathogens

3 讨论与结论

结合形态学特征与联合基因（ITS 和TUB2）序列分析以及致病性检测，将从黄晶果果实上分离得到的5 株病原菌分别鉴定为可可毛色二孢（L. theobromae）、蔷薇拟盘多毛孢（N. rosae）、间座壳真菌（D.pseudomangiferae）、层出镰孢菌（F. proliferatum）和棘孢曲霉（A. aculeatinus）。目前，尚未有黄晶果采后的相关研究，该研究为国际首次报道。

可可毛色二孢是多种植物的潜在病原菌，可引发整株植物死亡、果实和果蒂腐烂及叶斑等病症[8]。其中，龙眼果实焦腐病[9]、芋艿采后腐烂[10]、桑树根腐病[11]、杧果流胶病菌[12]、茶树叶斑病[13]等病害的病原菌经鉴定均为可可毛色二孢。研究发现可可毛色二孢菌丝生长迅速，回接至健康果实2 d 即可引起果皮变褐腐烂，迅速滋生大量白色霉层，接种3 d 后整个果实渗出大量组织液，果肉迅速软腐，由此表明，该菌为黄晶果采后的优势致病菌。Zhang 等[14]的研究表明，由可可毛色二孢引起的龙眼褐变腐烂与龙眼果实的膜脂代谢密切相关，研究发现可可毛色二孢侵染黄晶果果实后迅速造成果实软腐和组织液外泄，这可能与该菌影响了黄晶果的膜脂代谢相关，尚有待于进一步研究。蔷薇拟盘多毛孢和间座壳真菌是内生真菌，但亦能引发宿主植物发病[15-16]。研究表明，这两株真菌能造成黄晶果的采后腐烂，这可能是因为黄晶果采后贮藏期间抗性下降，使作为条件致病菌的蔷薇拟盘多毛孢和间座壳真菌的活性增强，从而导致采后果实病害爆发，果实腐烂败坏，严重影响了黄晶果的经济价值。

镰刀菌属微生物生长过程中能够产生真菌毒素，研究结果表明，病原菌D 与层出镰孢菌亲缘关系较近，而该菌已被证明是产生伏马菌素的主要菌种之一，该类毒素能够引起人类多种疾病[17-18]。另外，作为一种重要的植物病原菌，层出镰孢菌能够引起芒果畸形[19]、番茄叶斑病[20]、百合枯萎病[21]和香蕉[22]、桃子[23]、菠萝[24]、大蒜[25]等果实采后褐变腐烂。黄晶果被层出镰孢菌侵染后发病症状较隐蔽，发病初期仅呈现为凹陷小斑，极易引起消费者误食而摄入真菌毒素。因此，在贮藏期间控制该类病原菌能够有效降低食品安全事件发生的风险。

棘孢曲霉既是一种重要的工程菌株[26]，又是红毛丹[27]、黄秋葵[28]等宿主植物上的重要病原菌。该研究首次报道上述菌株为黄晶果果实的腐烂致病菌。

研究选用黄晶果果实作为试验材料，对其采后病原菌进行分离、鉴定，基本明确了黄晶果采后致病菌的种类、致病性及其发展情况，对黄晶果贮藏保鲜技术的研究具有指导意义。但由于病原菌的生长繁殖受外界环境影响较大，且不同黄晶果品种的病原菌种类和分离频率存在一定差异，而现有的商品化黄晶果品种有限，因此，在后期将进一部对黄晶果不同品种开展相关研究，为后期黄晶果采后病害的研究及防控提供理论依据。