口含烟中致病菌双重实时荧光PCR检测法的建立

傅婧 佘娟 董睿

目的：建立口含烟中肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的双重荧光PCR检测法。方法：在NCBI中检索肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的毒素基因序列，设计引物和探针;对收集到的肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌各10株菌株进行实验检测，检查方法特异性;制作阳性质粒稀释梯度，探索方法检出限;调取30批次实际样品，验证方法实用性。结果：建立的双重荧光PCR法可准确检测肠道沙门氏菌sseL基因、金黄色葡萄球菌Coa基因，檢出限低至10 copies/μL;在实际样品的方法比对中与标准培养法结果相同。结论：双重荧光PCR法可有效缩短口含烟中肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的检测时间并减少实验操作，具有一定实用价值。

口用型无烟气烟草制品通俗称为口含烟，主要分类有胶基烟、袋装口含烟、含化烟等，在欧美国家占有一定市场份额，近年来在我国的市场占有率也快速增长。在产品分类上，口含烟属于食品，安全指标包括感官、物理、化学、微生物等多项检测。其中，微生物指标包括菌落总数、大肠菌群、霉菌、致病菌检测。

Sa. enterica、St. aureus的基因检测研究较为深入，通常选择16S rRNA序列或毒素基因作为靶标。16S rRNA是目前最常用的细菌系统分类分子钟，但一些报道称在致病菌检测上存在一定误检率;另一方面，随着对致病菌毒性机理的深入研究，已有若干毒素基因可供筛选检测，特异性更强。本研究设计了毒素基因的引物和探针，在收集到的Sa. enterica、St. aureus菌株上进行验证，从而建立口含烟中Sa. enterica、St. aureus双重实时荧光PCR检测法。

1 材料

1.1 菌种来源：从ATCC、CMCC、CTCC等菌种库购买，从本地医院、疾控中心、质检院等单位获赠各10株肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。

1.2 标靶基因：检索NCBI的Genbank后获得肠道沙门氏菌sseL（Salmonella secreted factor L）基因和金黄色葡萄球菌Coa（Staphylocoagulase）基因序列50条以上，首先用Lasergene v11.2.1中的MegAlign软件比对出保守序列，使用Oligo v7.60设计引物和探针，再用NCBI的Primer-Blast验算筛选，最后进行实践验证。

2方法

2.1 DNA提取：所有Sa. enterica菌株用BPW培养基、St. aureus菌株用7.5%NaCl肉汤培养基在36 °C增菌18 h，取100 μL用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA作为验证材料。

2.2 定量标准曲线：特选Sa. enterica菌株CMCC（B）50071、St. aureus菌株ATCC6538的DNA提取液，用表1所述引物扩增目的基因，切胶回收后接入pMV-20T载体，转化至感受态E. coli细胞JM109，提取质粒并稀释至106 copies/μL，最后再将2种质粒稀释混制成105 copies/μL的阳性质粒标液，再用超纯水按10倍逐级稀释，形成105、104、103、102、10 copies/μL浓度的标准曲线。

2.3 阴性及空白对照组：阴性对照组包括志贺氏菌（CICC21535）、溶血性链球菌（CICC10373）、副溶血性弧菌（CICC21617）、单核细胞增生李斯特氏菌（CICC21633）、大肠杆菌O157

3 结果

3.1 验证结果

阴性对照组（NC）和空白对照（BC）无FAM、VIC荧光对数增长，Ct值 ≥ 40.0。用于验证的10株Sa. enterica菌株在FAM/sseL、10株St. aureus菌株在VIC/Coa荧光信号上均有对数增长，且15.0 ≤ Ct值 ≤ 35.0。此外，所用的St. aureus基因组与Sa. enterica基因组也互为阴性对照，分别在FAM、VIC信号上无荧光对数增长，Ct值 ≥ 40.0。

S. e.：10株Sa. enterica菌株荧光曲线，S. a.：10株St. aureus菌株荧光曲线，NC：5株阴性对照株曲线，BC：空白对照超纯水曲线。

3.2 定量检测

FAM/sseL、VIC/Coa标准梯度的荧光信号均有对数增长，FAM/sseL标曲Slope -3.46、R2> 0.99，VIC/Coa标曲Slope -3.57、R2> 0.99。30批次实际样品中，1批次含化烟检出Sa. enterica、1批次口含烟检出St. aureus。用设备自有的荧光PCR仪软件计算出样品中sseL和Coa拷贝数分别为27.46copies/μL、3.24×102 copies/μL。上述30批次样品使用GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016进行对照实验，同批次检出Sa. enterica阳性、St. aureus阳性，其余为阴性，与定量检测的定性结果一致。

4 讨论

经上述验证，本文设计的引物和探针组对本研究收集的小样本菌株以及实际样品的Sa. enterica、St. aureus能够有效检出，检出限≥10 copies/μL，与文献报道的处于同一量级[]。相比传统方法的反复增菌筛选过程，PCR技术具有快速简便的优势，实时荧光PCR技术更具有原位定量的特性，能够还原解析样品自身状态。

在定量限方面，可见标准质粒10 copies/μL浓度的Ct值已接近35，较为合适。原因为在实际检测中，为兼顾准确与效率，一般将反应循环数设为40;因此，若阳性结果Ct值太接近循环数，不便于确定检测结果。

在致病菌检测领域，分子生物学方法较为适合。致病菌rRNA检测方向上一般以16S rRNA为对象，但随着基因测序的快速积累，23S、ITS也在分型鉴定中启到重要作用。毒素基因方向上，常见致病菌如Sa. enterica、St. aureus及各血清型的毒性机理研究已颇为深入，多种相关基因已用于PCR类检测，前景较好。

口含烟作为即食食品，除了致病菌检测，常规微生物检测是更重要的安全指标。但由于分子生物学检测的指向性较强，对于菌落总数、大肠菌群、霉菌等广谱检验反而较难适用。例如对于菌落总数、霉菌、酵母等指标，rRNA类操纵子在不同菌种间数量差异较大，难于定量;对于大肠菌群、耐热大肠菌群等指标，卫生学范围与遗传学范围无法完全重合。

参考文献

[1] 陈超英. 变革与挑战：新型烟草制品发展展望[J]. 中国烟草学报， 2017， （3）： 14-18.

[2] 食品安全抽检监测司. 国家食品安全监督抽检实施细则（2021年版）[M]. 北京： 国家市场监督管理总局， 2021.

作者简介：傅婧，1988年5月，女，汉，籍贯：贵州省贵阳市，学历：硕士研究生，职称：助理工程师（初级），研究方向：烟草行业信息化建设

基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合字[2013]2059号）;贵州省质量技术监督局科研项目（编号：2017kj004号）。