陈酿玫瑰酵素理化特性及抗氧化活性

魏雪琴 ，黄珍珍，刘芳，程洁远，庞杰

1.武夷学院茶与食品学院（武夷山 354300）；2.福建农林大学食品科学学院博士后流动站（福州 350002）

2019年7 月起实施的QB/T 5324—2018《酵素产品分类导则》明确将酵素（Jiaosu）定义为是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品；同步实施的QB/T 5323—2018《植物酵素》中规定，以可用于食品加工的植物为主要原料制得的可供人类食用的酵素称为食用植物酵素（edible plant Jiaosu）。近年，食用植物酵素已在中国、日本及其他亚洲国家地区盛行[1]。以新鲜果蔬、菌菇、中草药等单一或复合植物为原料，经多种益生菌发酵而成的酵素含有丰富的维生素、氨基酸、多糖、多酚、酶、矿物质和微生物次生代谢产物等营养成分[2-3]，并具有抗氧化、抗菌消炎、调节肠道菌群、解酒、减肥、增强机体免疫能力等多种功能[4-8]。2019年，国家发展和改革委员会将“酵素生产工艺技术开发及工业化、规范化生产”列入《产业结构调整指导目录（2019年本）》鼓励类，作为新兴的功能性微生物发酵产品，酵素越来越受到产业界和学术界广泛关注。

玫瑰（Rosa rugosaThunb.）是蔷薇科蔷薇属直立落叶灌木，兼具观赏、药用、食用和饮用等价值[9]。据《本草纲目拾遗》记载：“玫瑰花活血、行血、健脾降火、理气调经、滋补养颜”。现代研究表明，玫瑰花瓣富含多酚与黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎等功能[10-11]。目前，以玫瑰为原料开发的发酵产品主要有玫瑰酵素、玫瑰酱、玫瑰酒、玫瑰醋等，其中玫瑰酵素附加值高，市场潜力巨大。

传统酵素生产偏向采用能有效保留原料活性物质的自然发酵工艺，通过添加蜂蜜、红糖或白糖等外源碳源提高酵素营养价值及功效，发酵周期一般为几个月至2年不等[12-14]。据报道，松针酵素陈酿期间，各组分经氧化还原、酯化、缩合、聚合等复杂生理生化反应，其营养成分会发生增加与减少，其中发酵2年的松针酵素营养价值最高[15]；添加富含还原糖的蜂蜜制备的葡萄酵素，其酵母菌数量增长速度及最大细胞浓度显著高于添加红糖和白糖组[13]。目前以蜂蜜为碳源的陈酿玫瑰酵素研究鲜见报道[16]。以新鲜玫瑰花瓣为原料，通过添加蜂蜜进行2年自然发酵，获得陈酿玫瑰酵素，测定其理化成分、酶活力及其体外抗氧化活性，并与按相同发酵工艺制备的洛神花酵素和相同陈酿期的市售玫瑰酵素进行比较分析，以期科学评价陈酿玫瑰酵素的理化品质和抗氧化能力，并为高附加值玫瑰酵素产品研发及玫瑰酵素功能性评价研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁、没食子酸标准样品（色谱纯，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；福林酚试剂，上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海蓝季生物有限公司。总蛋白定量测试盒（BCA法）、过氧化氢酶（CAT）测试盒（可见光法）、α-淀粉酶（AMS）测试盒（碘-淀粉比色法）、总抗氧化能力（T-AOC）测试盒，自南京建成生物工程研究所。其余化学药品均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。蜂蜜，市售。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；HI 2221型pH计（意大利HANNA公司）；BSA224S型电子分析天平（德国赛多利斯集团）；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；SB-25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；GZY-P20-Y型超纯水机（湖南科尔顿水务有限公司）；Neofuge 15R型高速冷冻离心机（香港力康生物医疗科技）；移液枪（德国Brand公司）；ABSON MixPlus型涡旋振荡器（合肥艾本森科学仪器公司）。

1.3 方法

1.3.1 酵素的制备

将新鲜玫瑰花花瓣、蜂蜜和水按1∶3∶10的质量比装桶混合进行室温发酵。经第1个月定期排气并搅拌后，密封，自然发酵2年，离心，室温贮藏备用。按照相同工艺制备洛神花酵素。同时，选购市售玫瑰酵素和果蔬酵素进行平行对比试验。市售酵素的具体信息如表1所示。

表1 市售酵素试样信息

1.3.2 基本理化指标测定

pH：采用pH计直接测定。

总酸的测定：采用电位滴定法，参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，结果以g乳酸/kg表示。

粗多糖的测定：采用苯酚-硫酸法，参照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定》，测定波长为490 nm，以葡萄糖的质量浓度为横坐标（x，μg/mL），以吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.003 8x-0.002 2，R2=0.999 7。酵素样品测定参照标准曲线绘制方法测定吸光度，并代入回归方程计算不同酵素试样中的粗多糖含量，每组做3个重复。

总蛋白的测定：采用BCA法，取20 μL稀释的酵素离心上清液，按照试剂盒说明书进行具体操作，测定波长为562 nm。

1.3.3 总酚的测定

采用Folin-Ciocalteu比色法[17]，分别准确吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL 12 μg/mL的没食子酸标准溶液，加水补足至5.5 mL后，分别加入2.5 mL 10%（V/V）的入福林酚试剂以及2 mL 7.5 mg/mL的Na2CO3溶液，在45 ℃水浴中反应15 min后，充分振荡混匀，常温避光静置1 min后，在波长765 nm处测定吸光度。以没食子酸的质量浓度为横坐标（x，μg/mL），以吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.02x+0.000 2，R2=0.999 1。样品测定：取5.5 mL稀释的酵素离心上清液，按上述相同步骤操作，将测定的吸光度代入回归方程计算不同酵素试样中的总酚含量，每组做3个重复。

1.3.4 总黄酮含量测定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，分别准确吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL 0.15 mg/mL芦丁标准溶液，用30%的乙醇补足至5.0 mL后，加入0.5 mL 5% NaNO2溶液，振荡均匀，静置6 min；再加入0.5 mL 10% Al(NO3)3溶液，振荡均匀，静置6 min；最后加入3.0 mL 4% NaOH溶液，振荡混匀后，静置15 min，在510 nm处测定吸光度。以芦丁的质量浓度为横坐标（x，mg/mL），以吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程为：y=6.623 8x+0.001 4，R2=0.999 2。样品测定：取5.0 mL稀释的酵素离心上清液，按上述相同步骤操作，将测定的吸光度分别代入回归方程计算不同酵素试样中的总黄酮质量分数，每组做3个重复。

1.3.5 酶活力测定

超氧化歧化酶（SOD）：采用邻苯三酚自氧化法，参照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》进行测定。

过氧化氢酶（CAT）活力测定：取100 μL稀释的酵素离心上清液，按照CAT测试盒说明书进行具体操作，测定波长为405 nm，其中酶活力定义：1 mL试样溶液每秒钟分解1 μmol的过氧化氢的量为一个酶活力单位（U），酵素试样中CAT活力以U/L表示。

α-淀粉酶（AMS）活力测定：取100 μL稀释的酵素离心上清液，按照AMS测试盒说明书所采用的碘-淀粉比色法进行具体操作，在660 nm波长处测定吸光度，其中酶活力定义：100 mL试样溶液中的AMS，在37 ℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉为一个酶活力单位（U），酵素试样中AMS活力以U/L表示。

1.3.6 总抗氧化能力（T-AOC）活力测定

取100 μL离心后的酵素原液，按照T-AOC测定试剂盒说明书进行具体操作，测定波长为520 nm。在37℃时，每分钟每毫升试样溶液使反应体系的吸光度每增加0.01，计为一个总抗氧化能力单位。酵素试样中总抗氧化能力以U/mL表示。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

取0.5 mL各稀释梯度的酵素试样溶液加至试管中，然后向每管加入2.5 mL 0.35 mg/mL的DPPH乙醇溶液，用涡旋混合器充分混匀，于37 ℃避光水浴30 min后在517 nm下测定吸光度。以乙醇做空白对照，蒸馏水调零。DPPH 自由基清除率按式（1）计算：

式中：A0为样品液+乙醇的吸光度；A1为DPPH乙醇溶液+样品液的吸光度；A2为DPPH乙醇溶液+乙醇的吸光度。

1.3.8 还原能力测定

釆用普鲁士蓝法进行测定，分别取1.0 mL不同体积分数的酵素溶液，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液，2.5 mL 0.01 mol/L铁氰化钾溶液，依次混匀后，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 0.1 mol/L三氯乙酸溶液，静置10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水及1 mL 0.001 mol/L三氯化铁溶液，摇匀后在波长700 nm处测定吸光度。吸光度越高，还原力越强。

1.3.9 数据处理

采用PASW statistics 18.0软件进行方差分析和Duncan’s多重比较差异显著性检验，显著性水平p＜0.05，数据表示为平均值±标准差（Mean±SD）。采用Origin 9.6b软件绘制图表和数据拟合。

2 结果与分析

2.1 基本理化指标

表2示出陈酿玫瑰酵素与洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素的基本理化指标。由表2可知，玫瑰酵素的pH、总酸和粗多糖浓度分别为3.40，17.02 g/kg和12.03 mg/mL，均符合QB/T 5323—2018《植物酵素》标准要求。酵素自然发酵过程属于复杂的混菌发酵体系，发酵期间微生物代谢能将糖类物质转换为醇、酸等，使体系pH下降，总酸增加，粗多糖降低[15]。由表2可见，玫瑰酵素的总酸、粗多糖浓度显著高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素，说明玫瑰酵素与其他三种酵素在糖酸类物质的积累与消耗方面的差异可能与原料品种及种类、发酵工艺、微生物菌群代谢作用不同有关。另外，玫瑰酵素的总蛋白质量浓度为45.42 mg/mL，也显著高于其他三种酵素，分别是洛神花酵素、市售玫瑰酵素和市售果蔬酵素蛋白质质量浓度的14，15和16倍。可见，自制陈酿玫瑰酵素较其他三种酵素更富含多糖和蛋白质。

表2 玫瑰酵素及其他酵素的基本理化特性比较

2.2 总酚和总黄酮含量

黄酮及多酚类化合物是植物中具有抗氧化的天然活性物质，可作为抗氧化剂提高机体清除自由基能力，植物经微生物产生的酶类及有机酸等的作用后，其总酚和总黄酮浓度会增加[18-20]。从图1可知，玫瑰酵素的总酚和总黄酮浓度均显著高于洛神花酵素和市售酵素，两种活性成分含量排序均为玫瑰酵素＞洛神花酵素＞市售玫瑰酵素＞市售果蔬酵素。其中，玫瑰酵素的总酚为6.55 mg/mL，分别是洛神花酵素（1.41 mg/mL）、市售玫瑰酵素（1.33 mg/mL）、市售果蔬酵素（0.60 mg/mL）的4.6，4.9和10.9倍；玫瑰酵素总黄酮浓度为1.55 mg/mL，分别是洛神花酵素（0.36 mg/mL）、市售玫瑰酵素（0.27 mg/mL）、市售果蔬酵素（0.11 mg/mL）的4.3，5.7和14.1倍，说明陈酿玫瑰酵素较其他三种酵素更具清除体内自由基的潜能。黄玲艳等[21]对玫瑰花和洛神花的总酚和总黄酮进行对比，结果表明，玫瑰的总酚浓度是洛神花的3.9倍，总黄酮浓度是洛神花的1.9倍。可见，陈酿酵素总酚、总黄酮浓度的差异与原料本身所含的总酚、总黄酮浓度直接相关，而玫瑰酵素与市售玫瑰酵素活性成分差异可能是发酵工艺不同导致。

图1 玫瑰酵素及其他酵素的总酚和总黄酮含量

2.3 酶活力

表3示出玫瑰酵素及其他酵素的SOD酶、淀粉酶及过氧化氢酶活力对比。由表3可知，玫瑰酵素SOD酶活力为25.72 U/mL，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中对食用植物酵素SOD酶活性的指标要求。玫瑰酵素SOD酶活力与市售玫瑰酵素相近，但低于洛神花酵素及复合发酵型的市售果蔬酵素。与表3中其他文献数据比较，玫瑰酵素的SOD酶活力高于采用9种水果加白砂糖自然发酵1个月获得的水果酵素[22]以及采用100种植物加白糖、红糖自然发酵18个月制备的植物综合酵素[23]，而低于添加酵母菌和植物乳杆菌发酵6个月的菠萝酵素[24]。据报道，植入酵母菌、乳酸菌等微生物菌的发酵方式的酵素SOD酶活力高于自然发酵[23]，并且不同碳源及不同发酵时期酵素微生物生长代谢及生物活性的调节作用有所差异，如以红糖为碳源的葡萄酵素SOD酶活力高于添加蜂蜜、白糖组[13]；菠萝、木瓜、芒果、火龙果等单一水果自然发酵约4个月形成的酵素SOD酶活性达到峰值，继续发酵至18个月其平均SOD酶活力降低约1.43倍[23]。可见，玫瑰酵素SOD酶活力与其他酵素的差异除与发酵原料有关外，可能还与发酵方式、发酵时间相关。

表3 玫瑰酵素及其他酵素酶活性

淀粉酶属于消化酶类，消化酶类可作为食品补充剂添加到功能食品中，以提高产品的助消化能力[25]。玫瑰酵素的淀粉酶活力为453.39 U/L，高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素及菠萝酵素，但较水果酵素低。过氧化氢酶是生物防御体系的关键酶之一，可促进H2O2分解，使细胞免受H2O2的毒害[26]。由表3可知，玫瑰酵素的过氧化氢酶活力为154.70 U/L，高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素，其中洛神花酵素未检测出过氧化氢酶活力。与SOD酶活力相比，表3中所有酵素的淀粉酶、过氧化氢酶活力均较低。冯彦君等[26]研究发现，麦苗酵素的过氧化氢酶活力较其发酵前的匀浆液活力提高98.71%，但过氧化氢酶活力低于SOD酶活力，这与此次试验结果吻合。

2.4 抗氧化活性

图2示出玫瑰酵素与其他酵素的总抗氧化能力对比。由图2可知，玫瑰酵素的总抗氧化能力为135.67 U/mL，显著高于洛神花酵素（44.96 U/mL）、市售玫瑰酵素（72.77 U/mL）和市售果蔬酵素（4.44 U/mL），其中玫瑰酵素的总抗氧化能力是市售果蔬酵素的30.6倍。

图2 玫瑰酵素及其他酵素的总抗氧化能力

图3进一步示出玫瑰酵素与市售果蔬酵素的还原能力和清除DPPH自由基能力对比。由图3可知，以市售果蔬酵素为参照，玫瑰酵素在更低的浓度范围内显示出更强的还原能力和更高的DPPH自由基清除能力。通常，物质的还原能力可作为其潜在抗氧化能力的重要体现。釆用普鲁士蓝法测定还原能力，吸光度越高，还原力越强。由图3（a）可知，玫瑰酵素具有一定还原性，且在较低浓度范围内，随着浓度的增大其吸光度明显增强，浓度由0.3%增加到1.8%，吸光度提高83.7%；而市售果蔬酵素浓度由4%提高到15%后，其吸光度仅提高22.6%。从图3（b）可见，不同浓度玫瑰酵素具有不同程度清除DPPH自由基的能力，清除能力与浓度呈正相关。经拟合计算，玫瑰酵素50%自由基清除率对应的浓度（IC50）约为0.32%，远低于市售果蔬酵素的IC50值（30.63%），说明玫瑰酵素抗氧化性远高于市售果蔬酵素。这与总抗氧化能力和还原能力的测定结果一致。据报道，不同酵素的抗氧化能力差异与原料和发酵液代谢产物等的不同有关[27]，自然发酵过程中主要以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等益生菌的代谢为主[28]，不同的发酵菌种产生的抗氧化酶类及菌种自身所具有的抗氧化能力的差异，会导致不同酵素呈现出不同的抗氧化性能；植物经微生物发酵后，其综合抗氧化能力会显著提高[20]，抗氧化能力的增加与多酚类物质的转化与代谢有关[29]，当发酵时间从360 d延长到720 d，酵素抗氧化性将趋于平衡[17]。综上所述，玫瑰酵素较其他三种酵素具有更强的抗氧化能力，结合图1及表2、表3结果，其原因可能是玫瑰酵素具有更高浓度的多糖、蛋白质、总酚和总黄酮等活性物质。

图3 玫瑰酵素及市售酵素的DPPH自由基清除能力（a）和还原能力（b）

3 结论

对陈酿玫瑰酵素的基本理化指标、总酚和总黄酮含量、酶活力及抗氧化活性进行了分析。经2年自然发酵获得的玫瑰酵素综合品质良好，其中总酸、粗多糖、总蛋白、总酚和总黄酮浓度以及α-淀粉酶活力、过氧化氢酶活力、总抗氧化能力均显著高于陈酿的洛神花酵素和市售酵素，还原能力和DPPH自由基清除能力高于市售果蔬酵素，SOD酶活力与市售玫瑰酵素相近。陈酿玫瑰酵素的其他活性成分和功能性评价仍需进一步深入研究。